猪白细胞介素6定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测猪血清
、血浆或细胞培养上清液中的IL-6浓度
。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏
。

猪IL-6简介
：

白介素6（IL-6）是一类多功能的蛋白

，在宿主防御

，急性期反应，免疫反应，造血功能，神经系统等方面起到重要的作用

。白介素6根据来源不同是分子量从21到28kDa不同的单链蛋白
。白介素6在多种细胞中都有表达
，如T细胞、巨噬细胞
、纤维原细胞
、肝细胞


、血管内皮细胞等。由于IL-6具有不同的活性，所以IL-6也被称为干扰素β2(IFN-β2)
、B细胞刺激因子-2(BSF-2)


、杂交瘤细胞生长因子
、肝细胞刺激因子
、毒性T细胞分化因子
、巨噬细胞粒细胞诱导因子(MGI-2A)。白细胞介素6在B-细胞向Ig分泌细胞的转化过程起到重要的作用
，参与了淋巴细胞和单核细胞的分化
，诱导神经细胞在B-细胞
，T-细胞

，肝细胞
，造血干细胞以及中枢神经系统的分化作用。此外，肌肉运动收缩作用后白细胞介素6会被释放到血液中
，进而能促进脂肪的分解并改善机体的胰岛素耐受性

。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-6的浓度。IL-6捕获抗体已预包被于酶标板上


，当加入标本或参考品时，其中的IL-6会与捕获抗体结合
，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗猪IL-6抗体后
，抗猪IL-6抗体与IL-6接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素
。生物素与亲合素特异性结合


，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去


。最后加入显色剂
，若样本中存在IL-6将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测



，读其450nm处的OD值
，IL-6浓度与OD₄₅₀值之间呈正比
，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-6浓度。

猪IL-6定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清
，避免在冰箱中凝固血液
；

C.血浆标本


，推荐用EDTA的方法收集


；

D.若待测样本不能及时检测
，标本收集后请分装

，冻存于－20℃
，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂






；

3.标本应清澈透明


，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除
。

4.请勿使用溶血

，高血脂或污染的标本检测


，否则结果将不准确。

注：猪血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测
。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液
。

3.标准品复溶加样后
，剩余部份请丢弃
。

4.底物请勿接触氧化剂和金属
。

5.加样时
，请及时更换枪头

，避免交叉污染
。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份
。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应
，请严格控制在25-28℃。

9.洗涤过程是至关重要的


，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟


；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存
。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5x标准品稀释液
，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)。

4.标准品: 按标签复溶体积加入pH8.4的1%BSA/PBS缓冲液使IL-6终浓度达到8000pg/ml


，室温反应，请严格控制在25～28℃


，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解
，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为8000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或猪工洗板：每孔洗涤液为300ul
，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次

。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干


。

实验过程需自备的材料

：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪




；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水














；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数

，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封
，保存于4℃
。

2.建议设置本底较正孔
，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液


。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中
，用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟
。对于血清或血浆标本

，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本
，如稀释量大

，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul
。      

4.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干

。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)
。用封板胶纸封住反应孔




，室温（25-28℃）孵育60分钟






。   

6.洗板5次


，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)


。用封板胶纸封住反应孔
，避光室温（25-28℃）孵育20分钟

。   

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔
，避光室温（25-28℃）孵育20分钟
。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效


，复孔的值平均后可作为测量值
。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值

。

3.手工绘制标准曲线




。以标准品浓度作横坐标

，OD值作纵坐标


，以平滑线连接各标准品的坐标点
。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测
，计算浓度时应乘以稀释倍数




。

典型数值和参考曲线

猪IL-6参考标准曲线

注意


：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量


。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度



：多次重复结果表明


，最小检出量为114pg/ml
。

2.特异性：与人、小鼠

、大鼠的IL－6均无交叉反应性。

3.重复性


：板内
，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Muller-Newen, G. (2003) Sci. STKE 2003:PE40.

2. Rose-John, S. et al. (2006) J. Leukoc. Biol. 80:227.

3. Mitsuyama, K. et al. (2006) Clin. Exp. Immunol. 143:125.

4. Hodge, D.R. et al. (2005) Eur. J. Cancer 41:2502.

5. Jung, H.C. et al. (1995) J. Clin. Invest. 95:55.

6. Jones, S.A. (2005) J. Immunol. 175:3468.

7. Bihl, M.P. et al. (2002) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27:48.

8. Naugler, W.E. and M. Karin (2008) Trends Mol. Med. 14:109.

9. Alberti, L. et al. (2005) Cancer Res. 65:2.

10. Schuett, H. et al. (2009) Thromb. Haemost. 102:215.