猪白细胞介素 1β定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用
。用于体外定量检测猪血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-1β浓度
。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。

IL-1β简介





：

白介素-1又称淋巴细胞激活因子,由 IL-1α和 IL-1β两种形式的多肽类细胞因子构成


，与许多的细胞活性相关
，包括增殖、分化以及凋亡, 主要由血液中的单核细胞和巨噬细胞所产生, 各种上皮细胞,内皮细胞和间质细胞也能产生IL-1β, 但血液中的IL-1β 主要是由单核细胞和巨噬细胞所产生的IL-1β

。

由激活巨噬细胞产生的IL-1β

，经蛋白酶-1酶解活化后



，成熟的白介素-1分子可以诱导白介素-2的释放、促进B细胞成熟与增殖
、诱导成纤维细胞生长因子活性，通过这些影响可以刺激胸腺细胞增殖，进而影响机体的免疫反应。研究表明白介素-1蛋白与炎症初始反应相关
，起到调节因子的作用


，通常被认为是内源性致热原；细菌的内毒素或者一些非细菌的炎症因子都会诱导IL‐1产生，然后被释放到局部组织

，IL-1β含量升高表明机体内有组织损伤或者感染产生, 如败血症等。对IL-1β的研究主要集中在各种生理和病理免疫反应和炎症反应过程领域
。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-1β的浓度

。IL-1β捕获抗体已预包被于酶标板上
，当加入标本或参考品时
，其中的IL-1β会与捕获抗体结合

，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗猪IL-1β抗体后，抗猪IL-1β抗体与IL-1β接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素




。生物素与亲合素特异性结合
，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去

。最后加入显色剂
，若样本中存在IL-1β将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质
，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测
，读其450nm处的OD值，IL-1β浓度与OD₄₅₀值之间呈正比


，通过参考品绘制标准曲线
，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-1β浓度。

猪IL-1β定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作
；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可

；

B.血清标本应是自然凝固后

，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；

D.若待测样本不能及时检测

，标本收集后请分装

，冻存于－20℃

，避免反复冻融
。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明
，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血


，高血脂或污染的标本检测

，否则结果将不准确




。

注：猪血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测
。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶
，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液

。

3.标准品复溶加样后

，剩余部份请丢弃
。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染
。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份


。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要
，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀

。

8.室温反应，请严格控制在25-28℃




。

9.洗涤过程是至关重要的
，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔

。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长

检测前准备工作:

 1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟




；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存






。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)


。

3.如有5X准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使IL-1β终浓度达到4000pg/ml




，室温反应

，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点







，最高浓度为4000pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul
，注入与吸出间隔15-30秒


。洗板5次
。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干

。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头

；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机
；                     

4.去离子水或双蒸水



；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线
。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中




，用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟

。对于血清或血浆标本
，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本
，如稀释量大
，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul


。    

4.洗板5次

，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔
，室温（25-28℃）孵育60分钟
。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干

。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)
。用封板胶纸封住反应孔


，避光室温（25-28℃）孵育20分钟
。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

9.加入显色剂TMB100ul/孔


，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值




。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值

。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值
。

3.手工绘制标准曲线





。以标准品浓度作横坐标
，OD值作纵坐标

，以平滑线连接各标准品的坐标点
。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度



。

4.若标本OD值高于标准曲线上限

，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数


。

典型数值和参考曲线

猪IL-1β参考标准曲线

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度




，特异性和重复性:

1.灵敏度

：多次重复结果表明
，最小检出量为69pg/ml


。

2.特异性

：与猪的IL-1α、IL-1ra及 人的IL-1β无交叉反应性。与大鼠
、小鼠的IL-1β分别有1.4%

、0.39%的交叉反应性


。

3.重复性

：板内
，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Greenfeder, S.J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:13757.

2. Martinon, F. and J. Tschopp (2007) Cell Death Differ. 14:10.

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4. Huether, M.J. et al. (1993) Gene 129:285.

5. Slack, J. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:2513.

6. Kornman, K.S. (2006) Am. J. Clin. Nutr. 83:475S.

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8. Dinarello, C. et al. (2010) Nat. Immunol. 11:973.

9. Isoda, K. and F. Ohsuzu (2006) J. Atheroscler. Thromb. 13:21.