人促红细胞生成素(EPO)定量分析

酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清

、血浆或细胞培养上清液中的EPO浓度

。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏

。

EPO简介：

促红细胞生成素（EPO）是一个由肾脏产生的激素，能刺激骨髓基质生成红细胞。EPO是一个糖蛋白，分子量大约为30000~34000道尔顿




。人EPO是165个氨基酸的多肽及1个O位，3个N位连接的糖基有构成的复合物

。

组织中的氧浓度的改变决定了肾脏产生EPO速率的大小
。当组织溶氧浓度较低的时候





，就会刺激肾脏产生速率增加




，这会引起红细胞的生成的增加
。

检测血清中EPO的浓度
，可作为贫血病


、红细胞增多症


、发育不全的贫血症
、溶血引起的贫血症




、缺铁性贫血等病症的辅助诊断指标


。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中EPO 的浓度。EPO 捕获抗体已预包被于酶标板上



，当加入标本或参考品时

，其中的EPO 会与捕获抗体结合
，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。当加入生物素化的抗人EPO 抗体后

，抗人EPO 抗体与EPO 接合
，形成夹心的免疫复合物
，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素


。生物素与亲合素特异性结合

，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来


；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。最后加入显色剂
，若样本中存在EPO 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测


，读其450nm处的OD值，EPO 浓度与OD₄₅₀值之间呈正比

，通过参考品绘制标准曲线

，对照未知样本中OD值


，即可算出标本中EPO 浓度



。

人EPO定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可
；

B.血清标本应是自然凝固后
，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本





，推荐用EDTA的方法收集

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装
，冻存于－20℃




，避免反复冻融

。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂



；

3.标本应清澈透明




，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除

4.请勿使用溶血
，高血脂或污染的标本检测
，否则结果将不准确。

注：人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶

，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头



，避免交叉污染




。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份
。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要
，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀
。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃



。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大



。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔
。

11.加样过程中避免气泡的产生




。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长
。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)

。

3. 如有5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)

。

4.标准品:按标签复溶体积用标准品稀释液复溶使EPO终浓度达到1000pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解
，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为1000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板
：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干
。

实验过程需自备的材料


：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪


；

3.自动洗板机


；                     

4.去离子水或双蒸水
；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数


，取出所需板条放置在框架内


，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封
，保存于4℃
。

2.建议设置本底较正孔

，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液

。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线
。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中
，用封板胶纸封住反应孔
，室温（25-28℃）孵育120分钟


。对于血清或血浆标本
，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本
，如稀释量大

，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。      

4.洗板5次

，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔



，室温（25-28℃）孵育60分钟

。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

7.加入亲和素连接的HRP酶(100ul/孔)

。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干

。

9.加入显色剂TMB100ul/孔
，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效
，复孔的值平均后可作为测量值






。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值

。

3.手工绘制标准曲线
。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标
，以平滑线连接各标准品的坐标点
。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度
。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测


，计算浓度时应乘以稀释倍数
。

典型数值和参考曲线

人EPO参考标准曲线

注意



：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明

，最小检出量为7.8pg/ml
。

2.特异性
：与人IL-1b , IL-1ra , IL-2, IL-3 , IL-4 , IL-5 , IL-6 , IL-8 ,IL-10,小鼠 EPO没有交叉反应
。

3.重复性
：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Bohling, T. et al. (1987) Erythropoietin in capillary hemangioblastoma in Acta Neuropathol. 74:324.

2. Spivak, J.L. The Mechanism of Action of Erythropoietin. Int J Cell Cloning 1986; 4: 139-166.

3. Jelkmann, W. (1992) Erythropoietin: structure, control of production, and function in Physiol. Reviews 72:449.

4. Spivak, J.L. et al. (1989) Serum immunoreactive erythropoietin in HIV-infected patients in J. Am. Med. Assoc. 261:3104.