产品说明(可下载)人的D因子定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用 。用于体外定量检测人血清 、血浆或细胞培养上清液中的D因子浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整 。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。
人D因子简介：
D因子,也叫Adipsin，属于肽酶S1家族的分泌蛋白 。人的D因子分泌形式是253个氨基酸构成，包括20个氨基酸的信号肽 ，5个氨基酸的活化片段和具体成酶活性的228个氨基酸的结构组成 。
D因子作用于C3bB，可使此复合物中的B因子裂解 ，形成C3bBb ，C3bBb作为转化酶可使C3裂解为C3a和C3b从而激活补体系统的旁路途径 。
D在许多组织中都表达 ，包括单核/巨噬细胞、肌肉组织 、坐骨神经 、子宫内膜、肾脏 、肠等 ，在脂肪组织中表达量特别高。
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中D因子的浓度 。D因子捕获抗体已预包被于酶标板上 ，当加入标本或参考品时，其中的D因子 会与捕获抗体结合 ，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去 。当加入生物素化的抗人D因子 抗体后 ，抗人D因子 抗体与D因子 接合，形成夹心的免疫复合物 ，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去 。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素 。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来 ；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂 ，若样本中存在D因子 将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测 ，读其450nm处的OD值，D因子 浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线 ，对照未知样本中OD值 ，即可算出标本中D因子 浓度 。
人D因子定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分 | 规格（96T/48T） |
人D因子预包被板 | 12条/6条 |
样本分析缓冲液 | 5ml/3ml |
5×标准品稀释液 | 10ml/5ml |
人D因子标准品 | 2/1支(冻干) |
人D因子生物素化抗体 | 10ml/5ml |
亲和素连接的HRP酶 | 10ml/5ml |
浓缩洗涤液 20× | 30ml/15ml |
TMB底物 | 10ml/5ml |
中止液 | 5ml/3ml |
封板胶纸 | 3/2张 |
说明书 | 1份 |
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作；
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可 ；
B.血清标本应是自然凝固后 ，取上清，避免在冰箱中凝固血液；
C.血浆标本 ，推荐用EDTA的方法收集 ；
D.若待测样本不能及时检测 ，标本收集后请分装，冻存于－20℃ ，避免反复冻融。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；
3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除 。
4.请勿使用溶血 ，高血脂或污染的标本检测 ，否则结果将不准确 。
注：人血清或血浆样本请用标准品稀释液稀释后再检测 。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2～8℃ 。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶 ，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液 。
3.标准品复溶加样后 ，剩余部份请丢弃。
4.底物请勿接触氧化剂和金属 。
5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染 。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要 ，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀 。
8.室温反应 ，请严格控制在25～28℃ 。
9.洗涤过程是至关重要的 ，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大 。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔 。
11.加样过程中避免气泡的产生 。
12.血清和血浆标本的检测时 ，检测抗体的孵育时间应适当延长 。
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟 ；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。
3.如有5X准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水) 。
4.标准品: 按标签复溶体积加入1X标准品稀释液复溶使D因子终浓度达到2000pg/ml ，室温反应 ，请严格控制在25～28℃ ，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解 ，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中 。（标准曲线取七个点 ，最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板 ：每孔洗涤液为300μl ，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干 。
实验过程需自备的材料：
1.不同规格的加样枪及相应的枪头 ；
2.酶标仪 ；
3.自动洗板机；
4.去离子水或双蒸水 ；
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数 ，取出所需板条放置在框架内 ，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃ 。
2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线 。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中 ，用封板胶纸封住反应孔 ，室温（25～28℃）孵育120分钟 。如果是血清血浆样本，不同样本稀释比例不一样 ，一般范围在300~30000倍，细胞上清样本5倍稀释。如无明确范围 ，建议从2000倍开始 ，加样稀释说明如下 ：每孔先加样本分析缓冲液50ul ，再加用1×标准品稀释液稀释5倍后的样本，加样量为50ul。
4.洗板5次 ，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔 ，室温（25～28℃）孵育60分钟 。
6.洗板5次 ，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔) 。用封板胶纸封住反应孔 ，避光室温（25～28℃）孵育20分钟 。
8.洗板5次 ，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟 。
10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值 。
结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效 ，复孔的值平均后可作为测量值 。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值 。
3.手工绘制标准曲线 。以标准品浓度作横坐标 ，OD值作纵坐标 ，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限 ，应适当稀释后重测 ，计算浓度时应乘以稀释倍数。
典型数值和参考曲线
浓度pg/ml | 典型OD值1 | 典型OD值2 | OD平均值 |
0 | 0.0826 | 0.1142 | 0.0984 |
62.5 | 0.2781 | 0.3093 | 0.2937 |
125 | 0.4445 | 0.5071 | 0.4758 |
250 | 0.7101 | 0.7653 | 0.7377 |
500 | 1.0592 | 1.1056 | 1.0824 |
1000 | 1.5149 | 1.5737 | 1.5443 |
2000 | 2.0832 | 2.1862 | 2.1347 |
人D因子参考标准曲线
注意 ：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量 。
灵敏度，特异性和重复性:
1.灵敏度 ：多次重复结果表明 ，最小检出量为17pg/ml 。
2.特异性 ：与人的Coagulation Factor （凝结因子）II、Coagulation Factor X 、Coagulation Factor XI及小鼠和大鼠的D因子无交叉反应性 。
3.重复性：板内 ，板间变异系数均<10%.
参考文献:
1. Volanakis, J.E. et al. (1996) Protein Sciences 5:553.
2. Sanders, P.W. et al. (1986) J. Clin. Invest. 77:1299.
3. Xu, Y. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:14577.
4. Biesma, D.H. et al. (2001) J. Clin. Invest. 108:233.
5. Cook, K.S. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6480.
6. Sprong, T. et al. (2006) Blood. 107:4865
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