人凝血因子III定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用



。用于体外定量检测人血清
、血浆或细胞培养上清液中的凝血因子III浓度
。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整



。如有产品包装破损或质量投拆

，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏
。

凝血因子III 简介
：

凝血因子III也被称为组织因子




、F3以及CD142，属于组织因子家族的单通道I型膜蛋白
，其大小约为47 kDa。凝血因子III由295氨基酸组成
，包含了一个信号肽（1-32号残基）和一个完整的肽链（33-295号残基）。作为I型膜蛋白，它包含一个跨膜区域（252-274号残基）和胞质尾

。

凝血因子III作为一种蛋白质参与止血和炎症过程
。在血管损伤后
，组织因子通过绑定并激活血浆丝氨酸蛋白酶（VIIa因子）
，激活凝血系统。此外，凝血因子III还能够阻止细胞凋亡，增强肿瘤细胞系的生存能力。但是，凝血因子如何调控这些细胞过程尚未完全清楚
。

凝血因子III在在血管的皮下细胞中持续表达


，如血管平滑肌细胞
。而对其它细胞
，如内皮细胞和单核细胞，当受到细胞因子和生长因子刺激时也能表达凝血因子III
。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中凝血因子III的浓度


。凝血因子III捕获抗体已预包被于酶标板上
，当加入标本或参考品时

，其中的凝血因子III会与捕获抗体结合




，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人凝血因子III抗体后
，抗人凝血因子III抗体与凝血因子III接合
，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素




。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来


；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂


，若样本中存在凝血因子III将会形成免疫复合物
，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质



，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测
，读其450nm处的OD值，凝血因子III浓度与OD₄₅₀值之间呈正比
，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值


，即可算出标本中凝血因子III浓度

。

人凝血因子III定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:  

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后
，取上清
，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集

D.若待测样本不能及时检测
，标本收集后请分装，冻存于－20℃

，避免反复冻融


。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明

，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除
。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测

，否则结果将不准确



。

注
：血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃
。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶

，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后
，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属

。

5.加样时，请及时更换枪头


，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要
，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀

。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的
，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大

。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔
。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时





，检测抗体的孵育时间应适当延长

。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存

。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)

。

3.如有5X准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)
。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使凝血因子III终浓度达到1000pg/ml


，室温反应
，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解

，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为1000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板





：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒


。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料
：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪
；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水

；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数
，取出所需板条放置在框架内
，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封
，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔
，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液

。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中


，用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟
。对于血清或血浆标本




，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本, 如稀释量大
，请将样本与样本分析缓冲液等量加入
，不足部分用标准品稀释液补充至100ul

。   

4.洗板5次



，且最后一次置厚吸水纸上拍干



。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育60分钟
。    

6.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)




。用封板胶纸封住反应孔
，避光室温（25-28℃）孵育20分钟
。

8.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

9.加入显色剂TMB100ul/孔

，避光室温（25-28℃）孵育20分钟

。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效




，复孔的值平均后可作为测量值


。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值
。

3.手工绘制标准曲线

。以标准品浓度作横坐标



，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点
。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度

。

4.若标本OD值高于标准曲线上限
，应适当稀释后重测
，计算浓度时应乘以稀释倍数





。

典型数值和参考曲线

人凝血因子III参考标准曲线

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量


。

灵敏度

，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为4.5pg/ml。

2. 特异性
：与人凝血因子VII 、,凝血因子X
、凝血因子XI
、凝血因子XIV，小鼠凝血因子III等没有交叉反应




。

3.重复性
：板内

，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Camerer, E. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5255.

2. Mueller, B.M. et al. (1998) J. Clin. Invest. 101:1372.

3. Mackman, N. et al. (2006) Blood Cells Mol. Dis. 36:104.

4.. Bavendiek, U. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:25032.

5. Belting, M. et al. (2004) Nature Med. 10:502.

6. Levi, M. (2007) Crit. Care Med. 35:2191.

7. Carmeliet, P. et al. (1996) Nature 383:73.