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人血管生成素ELISA试剂盒Human Angiogenin ELISA KIT
货号 :HH-94
价格    :¥3800.00
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人血管生成素定量分析酶联免疫检测试剂盒

 

本试剂盒仅供科研使用 。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的血管生成素浓度 。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组

分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆,请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。

 

人血管生成素简介:

人血管生素是一种非糖基化的多肽,有123个氨基酸残基组成 ,分子量为14 kDa    ,含有三个链内二硫键,属于核糖核酸酶家族。

血管生成素一般由血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞 、结肠柱状上皮细胞、淋巴细胞、腺癌细胞以及肿瘤细胞系等细胞产生   。血管生成素通常以分泌蛋白形式进入液中   ,其含量高达60-120 ng / mL 。

血管生成素作为核糖核酸酶与其它的核糖核酸酶家族成员一样 ,具有细胞毒性    ,其机理主要是抑制细胞蛋白质合成从而对细胞具有毒性。血管生成素也可以通过磷脂酶的活化,刺激毛细血管和脐静脉内皮细胞生成甘油二酯以及前列腺素的分泌。

 

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中血管生成素的浓度       。血管生成素捕获抗体已预包被于酶标板上  ,当加入标本或参考品时  ,其中的血管生成素会与捕获抗体结合 ,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去  。当加入生物素化的抗人血管生成素抗体后,抗人血管生成素抗体与血管生成素接合 ,形成夹心的免疫复合物   ,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素 。生物素与亲合素特异性结合 ,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来 ;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂  ,若样本中存在血管生成素将会形成免疫复合物,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质   ,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测,读其450nm处的OD值  ,血管生成素浓度与OD450值之间呈正比 ,通过参考品绘制标准曲线,对照未知样本中OD值,即可算出标本中血管生成素浓度。

 

人血管生成素定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分

规格(96T/48T)

人血管生成素预包被板

12条/6

5×标准品稀释液

20ml/10ml

人血管生成素标准品

8支/4支(冻干)

人血管生成素生物素化抗体

10ml/5ml

亲和素连接的HRP酶

10ml/5ml

浓缩洗涤液 20×

30ml/15ml

TMB底物

10ml/5ml

中止液

5ml/3ml

封板胶纸

3/2

说明书

1

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作   ;

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;

B.血清标本应是自然凝固后,取上清   ,避免在冰箱中凝固血液;

C.血浆标本  ,推荐用EDTA的方法收集    ;

D.若待测样本不能及时检测 ,标本收集后请分装 ,冻存于-20℃ ,避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;

3.标本应清澈透明 ,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除

4.请勿使用溶血 ,高血脂或污染的标本检测  ,否则结果将不准确   。

 

注意事项:

1.试剂盒请保存在28℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶  ,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液 。

3.标准品复溶加样后 ,剩余部份请丢弃 。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时 ,请及时更换枪头  ,避免交叉污染 。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份 。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要 ,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应  ,请严格控制在25-28℃ 。

9.洗涤过程是至关重要的,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔  。

11.加样过程中避免气泡的产生  。

12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长

 

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟      ;每次检测后剩余试剂请及时于2~8℃保存 。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)  。

3. 5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)  。

4.标准品: 按标签复溶体积加入1X标准品稀释液复溶使血管生成素终浓度达到500pg/ml ,室温反应    ,请严格控制在25~28℃ ,静置10~15分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解  ,用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中    。(标准曲线取七个点 ,最高浓度为300 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.)

图片2.png 

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板   :每孔洗涤液为300ul     ,注入与吸出间隔15-30秒  。洗板5次     。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干 。

 

实验过程需自备的材料:

1.不同规格的加样枪及相应的枪头;   

2.酶标仪 ;

3.自动洗板机 ;                     

4.去离子水或双蒸水 ;

 

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数   ,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封,保存于4℃ 。

2.建议设置本底较正孔 ,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液 。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线 。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中  ,用封板胶纸封住反应孔,室温(25-28℃)孵育120分钟。对于血清或血浆标本,请用1×标准品稀释液稀释至合适浓度检测,建议稀释100~8000倍  。         

4.洗板5次    ,且最后一次置厚吸水纸上拍干 。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/)。用封板胶纸封住反应孔,室温(25-28℃)孵育60分钟    。   

6.洗板5次  ,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的酶工作液(100ul/) 。用封板胶纸封住反应孔 ,避光室温(25-28℃)孵育20分钟 。   

8.洗板5次 ,且最后一次置厚吸水纸上拍干  。

9.加入显色剂TMB100ul/孔 ,避光室温(25-28℃)孵育20分钟  。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

 

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效   ,复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值   。

3.手工绘制标准曲线 。以标准品浓度作横坐标 ,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点 。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度 。

4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测    ,计算浓度时应乘以稀释倍数 。

典型数值和参考曲线

浓度pg/ml

典型OD1

典型OD2

OD平均值

0

0.064

0.082

0.073

15.625

0.217

0.253

0.235

31.25

0.427

0.451

0.439

62.5

0.703

0.803

0.753

125

1.025

1.123

1.074

250

1.486

1.61

1.548

500

2.066

2.282

2.174

Angiogenin参考标准曲线

图片1.png 

 

注意 :本图仅供参考 ,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量   。

 

灵敏度 ,特异性和重复性:

1.灵敏度 :多次重复结果表明 ,最小检出量为4.75pg/ml 。

2.特异性 :与EGF ,GM-CSF,MIP-1α,MIP-1β,TGF-α ,TGF-β1,小鼠 EGF  ,GM-CSF,MIP-1α等没有交叉反应 。

3.重复性 :板内 ,板间变异系数均<10%.

 

参考文献:

1. Moroianu, J. and J.F. Riordan (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1677.

2. Moenner, M. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 226:483.

3. Bond, M.D. et al. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1162:177.

4. Beintema, J.J. (1989) FEBS Lett. 254:1.

5. Hu, G-F. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2227.

6. Russo, N. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2920.


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