产品说明(可下载)人淋巴毒素α（TNF-β）定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用 。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的TNF-β浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整, 如有疑问请与安徽巧伊生物科技有限公司联系 ，尊龙凯时人生就是搏将提供力所能及的帮助。
TNF-β简介 ：
淋巴毒素α，也叫TNF-β ，是一个属于肿瘤坏死家族的分泌蛋白 。人的TNF-β是一个22 kDa的蛋白 。分泌型的TNF-β是三倍体。当然 ，TNF-β也能与淋巴毒素β形成三倍体 ，从而将TNF-β锚定在细胞表面 。TNF-β由活化的B淋巴细胞分泌 ，对自身免疫病的发生起重要作用 。
TNF-β介导不同类型的炎症反应 ，免疫刺激以及抗病毒等过程 。TNF-β除了对肿瘤细胞的细胞毒性外 ，TNF-β能刺激淋巴腺及淋巴结等淋巴器官的发育 ，参与淋巴器官的炎症及免疫功能 。TNF-β也参与次级淋巴器官的形成和生长 ，同时TNF-β也参与细胞调亡 。TNF-β的基因多态性也会诱导牛皮癣伴随着血清阴性的关节炎，即牛皮癣性关节炎。
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中TNF-β 的浓度。TNF-β捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时 ，其中的TNF-β会与捕获抗体结合 ，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去 。当加入生物素化的抗人TNF-β抗体后 ，抗人TNF-β抗体与TNF-β接合 ，形成夹心的免疫复合物 ，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去 。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素 。生物素与亲合素特异性结合 ，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来 ；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去 。最后加入显色剂，若样本中存在TNF-β将会形成免疫复合物 ，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质 ，在加入终止液后呈黄色 。通过酶标仪检测 ，读其450nm处的OD值 ，TNF-β浓度与OD450值之间呈正比 ，通过参考品绘制标准曲线 ，对照未知样本中OD值 ，即可算出标本中TNF-β 浓度。
人TNF-β定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分 | 规格（96T/48T） |
人TNF-β预包被板 | 12条/6条 |
标准品稀释液 | 10ml/5ml |
人TNF-β标准品 | 2/1支(冻干) |
人TNF-β生物素化抗体 | 10ml/5ml |
亲和素连接的HRP酶 | 10ml/5ml |
浓缩洗涤液 20× | 30ml/15ml |
TMB底物 | 10ml/5ml |
中止液 | 5ml/3ml |
封板胶纸 | 3/2张 |
说明书 | 1份 |
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作 ；
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；
B.血清标本应是自然凝固后，取上清 ，避免在冰箱中凝固血液 ；
C.血浆标本 ，推荐用EDTA的方法收集 ；
D.若待测样本不能及时检测 ，标本收集后请分装 ，冻存于－20℃ ，避免反复冻融。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；
3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
4.请勿使用溶血 ，高血脂或污染的标本检测 ，否则结果将不准确 。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2～8℃。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶 ，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
3.标准品复溶加样后 ，剩余部份请丢弃 。
4.底物请勿接触氧化剂和金属 。
5.加样时 ，请及时更换枪头 ，避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份 。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀 。
8.室温反应 ，请严格控制在25-28℃ 。
9.洗涤过程是至关重要的 ，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大 。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。
11.加样过程中避免气泡的产生 。
12.血清和血浆标本的检测时 ，检测抗体的孵育时间应适当延长
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟 ；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存 。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水) 。
3.如有5x标准品稀释液 ，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水) 。
4 标准品: 根据标签复溶体积加入标准品稀释液使TNF-β终浓度达到2000pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃ ，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点 ，最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul ，注入与吸出间隔15-30秒 。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干 。
实验过程需自备的材料 ：
1.不同规格的加样枪及相应的枪头 ；
2.酶标仪；
3.自动洗板机；
4.去离子水或双蒸水；
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数 ，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃ 。
2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液 。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中 ，用封板胶纸封住反应孔 ，室温（25-28℃）孵育120分钟 。4.洗板5次 ，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔) 。用封板胶纸封住反应孔 ，室温（25-28℃）孵育60分钟。
6.洗板5次 ，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
7.加入HRP酶结合物工作液(100ul/孔) 。用封板胶纸封住反应孔 ，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。
8.洗板5次 ，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟 。
10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值 。
结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效 ，复孔的值平均后可作为测量值 。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值 。
3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点 。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测 ，计算浓度时应乘以稀释倍数 。
典型数值和参考曲线
浓度pg/ml | 典型OD值1 | 典型OD值2 | OD平均值 |
0 | 0.065 | 0.074 | 0.0695 |
62.5 | 0.23 | 0.213 | 0.2215 |
125 | 0.448 | 0.413 | 0.4305 |
250 | 0.69 | 0.627 | 0.6585 |
500 | 1.096 | 0.975 | 1.0355 |
1000 | 1.588 | 1.428 | 1.508 |
2000 | 2.261 | 2.138 | 2.1995 |
人TNF-β参考标准曲线
注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量 。
灵敏度，特异性和重复性:
1.灵敏度 ：多次重复结果表明，最小检出量为15.4pg/ml 。
2.特异性 ：与人的GM-CSF ，IL-8 ，IL-1β， TNF-α及小鼠的TNF-α等没有交叉反应。
3.重复性：板内 ，板间变异系数均<10%.
参考文献：
1. Chiang, E.Y. et al. (2009) Nat. Med. 15:766.
2. Warzocha, K. et al. (1995) Eur. Cytokine Netw. 6:83.
3. Seleznik, G.M. et al. (2014) Cytokine Growth Factor Rev. 25:125.
4. Kobayashi, Y. et al. (1986) J. Biochem. 100:727.
5. Mapara, M.Y. et al. (1994) Int. J. Cancer 58:248.
6. Drutskaya, M.S. et al. (2010) IUBMB Life 62:283.
上海尊龙凯时人生就是搏生物科技有限公司
