人白细胞活化黏附因子定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的ALCAM浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆,请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。
人ALCAM简介:
白细胞活化黏附因子(ALCAM)也叫CD166,属于免疫球蛋白超家族且是 I 型膜糖蛋白。白细胞活化黏附因子有570个氨基酸构成5个细胞间免疫球蛋白样结构域,这些结构域能与自身或其它蛋白(CD6)结合而使细胞相互作用。但在内皮细胞内的分泌型的蛋白只有437个蛋白构成。
白细胞活化黏附因子可由多种组织和细胞产生,这些细胞包括:胸腺内皮细胞、血管内皮细胞、活化的淋巴细胞和单核细胞,甚至单核细胞产生的树突状细胞。
白细胞活化黏附因子能通过与自身及CD6、NgCAM、甚至某种脑蛋白的相互结合而起作用。与某种脑蛋白的的结合使其在突轴的延伸过程中起作用。白细胞活化黏附因子(ALCAM)与CD6的结合使其在T细胞的发育,调控方面扮演重要的作用。当然,白细胞活化黏附因子(ALCAM)也可与T细胞和B细胞结合而活化白细胞。最近研究表明,白细胞活化黏附因子(ALCAM)可使黑色素瘤的转移显著升高,提示白细胞活化黏附因子(ALCAM) 可能参与肿瘤转移过程。
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中ALCAM的浓度。ALCAM捕获抗体已预包被于酶标板上,当加入标本或参考品时,其中的ALCAM 会与捕获抗体结合,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人ALCAM 抗体后,抗人ALCAM 抗体与ALCAM 接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂,若样本中存在ALCAM 将会形成免疫复合物,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测,读其450nm处的OD值,ALCAM 浓度与OD450值之间呈正比,通过参考品绘制标准曲线,对照未知样本中OD值,即可算出标本中ALCAM 浓度。
人ALCAM定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分 | 规格(96T/48T) |
人ALCAM预包被板 | 12条/6条 |
5╳标准品稀释液 | 10ml/5ml |
人ALCAM标准品 | 4/2支(冻干) |
人ALCAM生物素化抗体 | 10ml/5ml |
亲和素连接的HRP酶 | 10ml/5ml |
浓缩洗涤液 20× | 30ml/15ml |
TMB底物 | 10ml/5ml |
中止液 | 5ml/3ml |
封板胶纸 | 3/2张 |
说明书 | 1份 |
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作;
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;
B.血清标本应是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;
C.血浆标本,推荐用EDTA的方法收集;
D.若待测样本不能及时检测,标本收集后请分装,冻存于-20℃,避免反复冻融。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;
3.标本应清澈透明,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
4.请勿使用溶血,高血脂或污染的标本检测,否则结果将不准确。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2~8℃。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
3.标准品复溶加样后,剩余部份请丢弃。
4.底物请勿接触氧化剂和金属。
5.加样时,请及时更换枪头,避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。
8.室温反应,请严格控制在25~28℃。
9.洗涤过程是至关重要的,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。
11.加样过程中避免气泡的产生。
12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长。
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25~28℃)平衡20分钟;每次检测后剩余试剂请及时于2~8℃保存。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。
3.如有5X准品稀释液,请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)。
4.标准品: 按标签复溶体积加入1X标准品稀释液复溶使ALCAM终浓度达到4000pg/ml,室温反应,请严格控制在25~28℃,静置10~15分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解,用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。(标准曲线取七个点,最高浓度为4000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.)
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板:每孔洗涤液为300μl,注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。
实验过程需自备的材料:
1.不同规格的加样枪及相应的枪头;
2.酶标仪;
3.自动洗板机;
4.去离子水或双蒸水;
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封,保存于4℃。
2.建议设置本底较正孔,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育120分钟。如果是血清血浆样本,不同样本稀释比例不一样,一般范围在60~600倍,如无明确范围,建议从100倍稀释,如果样本浓度过高,超过检测范围,请加大稀释倍数后重新稀释检测。
4.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育60分钟。
6.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。
8.洗板5次,且最后一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。
10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。
结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效,复孔的值平均后可作为测量值。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。
3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。
典型数值和参考曲线
浓度pg/ml | 典型OD值1 | 典型OD值2 | OD平均值 |
0 | 0.0931 | 0.0677 | 0.0804 |
125 | 0.2759 | 0.2427 | 0.2593 |
250 | 0.3989 | 0.3653 | 0.3821 |
500 | 0.7013 | 0.6435 | 0.6724 |
1000 | 1.0428 | 0.986 | 1.0144 |
2000 | 1.5119 | 1.4383 | 1.4751 |
4000 | 2.0878 | 2.0286 | 2.0582 |
人ALCAM参考标准曲线
注意:本图仅供参考,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。
灵敏度,特异性和重复性:
1.灵敏度:多次重复结果表明,最小检出量为37pg/ml。
2.特异性:与人E-Selectin、ICAM-2、ICAM-3、P-Selectin及小鼠的 ALCAM没有交叉反应。
3.重复性:板内,板间变异系数均<10%.
参考文献:
1. Cayrol, R. et al. (2008) Nat. Immunol. 9:137.
2. Degen, W.G. et al. (1998) Am. J. Pathol. 152:805.
3.Van, K. L. et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 25783 - 257890.
4.Hirata, H. et al., 2006, Cells Tissues Organs. 184 (3-4):172-180.
5. Buhusi, M. et al. (2009) J. Neurosci. 29:15630.