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人的巨噬细胞迁移抑制因子ELISA试剂盒Human MIF ELISA KIT
货号:HH-85
价格    :¥3800.00
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人巨噬细胞迁移抑制因子定量分析酶联免疫检测试剂盒

 

本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测人血清 、血浆或细胞培养上清液中的MIF浓度   。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整 。如有产品包装破损或质量投拆   ,请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。

 

MIF简介:

巨噬细胞迁移抑制因子(MIF) 是一种许多种炎症反应和病理中起作用的促炎症细胞因子。人的MIF基因编码115个氨基酸,分泌形式是分子量为12.5 kDa无糖基的蛋白。

MIF除了抵制巨噬细胞迁移  ,还在许多生物过程如接触反应活性 ,免疫、激素分泌的调节和炎症反应中扮演重要的角色  。

MIF由免疫系统的单核/巨噬细胞、T细胞和B细胞、嗜中性粒细胞等分泌    ,也可由其它类型的细胞如肺 、肝 、乳腺、结肠和前列腺肿瘤的恶性细胞表达   。最近的研究表明,MIF可能在慢性炎症转化为肿瘤的病理中起联系作用的分子。

 

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中MIF的浓度。MIF捕获抗体已预包被于酶标板上  ,当加入标本或参考品时 ,其中的MIF 会与捕获抗体结合 ,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人MIF 抗体后 ,抗人MIF 抗体与MIF 接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离的成分通过洗涤的过程被除去  。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素 。生物素与亲合素特异性结合   ,亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来 ;其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂 ,若样本中存在MIF 将会形成免疫复合物   ,辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质 ,在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测 ,读其450nm处的OD值   ,MIF 浓度与OD450值之间呈正比,通过参考品绘制标准曲线  ,对照未知样本中OD值,即可算出标本中MIF 浓度 。

MIF定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

组分

规格(96T/48T)

人MIF预包被板

12条/6

样本分析缓冲液

5ml/3ml

5×标准品稀释液

10ml/5ml

人MIF标准品

8/4支(冻干)

人MIF生物素化抗体

10ml/5ml

亲和素连接的HRP酶

10ml/5ml

浓缩洗涤液 20×

30ml/15ml

TMB底物

10ml/5ml

中止液

5ml/3ml

封板胶纸

3/2

说明书

1

 

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作;

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可;

B.血清标本应是自然凝固后,取上清 ,避免在冰箱中凝固血液;

C.血浆标本   ,推荐用EDTA的方法收集 ;

D.若待测样本不能及时检测,标本收集后请分装,冻存于-20℃    ,避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂;

3.标本应清澈透明    ,检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血  ,高血脂或污染的标本检测 ,否则结果将不准确。

注:人血清或血浆样本请用标准品稀释液稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在28℃  。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶 ,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液 。

3.标准品复溶加样后 ,剩余部份请丢弃 。

4.底物请勿接触氧化剂和金属   。

5.加样时   ,请及时更换枪头,避免交叉污染    。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份   。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要,在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀   。

8.室温反应,请严格控制在25~28℃ 。

9.洗涤过程是至关重要的  ,洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时,检测抗体的孵育时间应适当延长  。

 

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25~28℃)平衡20分钟   ;每次检测后剩余试剂请及时于2~8℃保存 。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)  。

3.如有5X准品稀释液,请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水) 。

4.标准品: 按标签复溶体积加入1X标准品稀释液复溶使MIF终浓度达到2000pg/ml   ,室温反应 ,请严格控制在25~28℃   ,静置15~20分钟后轻轻混悬(建议抽吸几次)待彻底溶解 ,用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中 。(标准曲线取七个点,最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.)

图片2.png 

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板:每孔洗涤液为300μl ,注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次   。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干 。

 

实验过程需自备的材料 :

1.不同规格的加样枪及相应的枪头   ;  

2.酶标仪  ;

3.自动洗板机;                    

4.去离子水或双蒸水 ;

 

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数 ,取出所需板条放置在框架内,暂时用不到板条请放回铝箔袋密封     ,保存于4℃ 。

2.建议设置本底较正孔  ,即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液   。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线 。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔    ,室温(25~28℃)孵育120分钟。如果是血清血浆样本 ,不同样本稀释比例不一样 ,一般范围在5~20倍 ,如无明确范围   ,建议从10倍开始 ,加样稀释说明如下 :每孔先加样本分析缓冲液50ul,再加用1×标准品稀释液稀释5倍后的样本,加样量为50ul。

4.洗板5次   ,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/) 。用封板胶纸封住反应孔,室温(25~28℃)孵育60分钟  。   

6.洗板5次  ,且最后一次置厚吸水纸上拍干  。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/)。用封板胶纸封住反应孔  ,避光室温(25~28℃)孵育20分钟。

8.洗板5次 ,且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔   ,避光室温(25~28℃)孵育20分钟 。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值 。

 

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效  ,复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值   。

3.手工绘制标准曲线 。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标 ,以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度   。

4.若标本OD值高于标准曲线上限  ,应适当稀释后重测 ,计算浓度时应乘以稀释倍数  。

典型数值和参考曲线

浓度pg/ml

典型OD1

典型OD2

OD平均值

0

0.0657

0.0853

0.0755

62.5

0.2609

0.2017

0.2313

125

0.494

0.4598

0.4769

250

0.8105

0.7649

0.7877

500

1.0826

1.0224

1.0525

1000

1.5565

1.4939

1.5252

2000

2.1103

2.0427

2.0765

MIF参考标准曲线

图片1.png 

注意:本图仅供参考 ,应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

 

灵敏度 ,特异性和重复性:

1.灵敏度:多次重复结果表明,最小检出量为18pg/ml。

2.特异性 :与人的IL-1 、IL-6、IL-8,ICAM 、SDF-1α、SDF-1βI及小鼠MIF无交叉反应性。

3.重复性:板内    ,板间变异系数均<10%.

 

参考文献:

1. Noels, H. et al. (2009) Trends Cardiovasc. Med. 19:76.

2. Zernecke, A. et al. (2008) Circulation 117:1594.

3. Weiser, W.Y. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7522.

4. Schwartz, V. et al. (2009) FEBS Lett. 583:2749.

5. Bacher, M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA


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