人的神经生长因子贝塔定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用





。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的β-NGF浓度


。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整
。如有产品包装破损或质量投拆
，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏
。

β-NGF简介：

NGF最初分离出来是非共价三聚体蛋白，分别由α
、β
、γ三个亚基组成，其中β亚基，也叫β-NGF，具有完整的NGF生物学活性。β-NGF由两条成熟的１２０个氨基酸多肽组成的同质二聚体形式分泌。人的β-NGF蛋白与小鼠和大鼠的β-NGF蛋白有90%的同源性
。

β-NGF 已被证明是强效的神经营养因子
，在外周神经中感觉神经元和交感神经系统的发育起到重要的作用。此外，β-NGF还是一个多功能的细胞因子
，已有研究表明
，β-NGF在免疫调节中扮演重要的角色，像IL-1,TNF-α , PDGF和 TGF-β等细胞因子能够刺激星形胶质细胞的NGF的分泌增强
。NGF也可刺激人的B淋巴细胞的生长和分化，同时也证明了在小鼠中NGF具有抑制腹膜中性粒细胞的调亡。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中β-NGF的浓度

。β-NGF捕获抗体已预包被于酶标板上






，当加入标本或参考品时

，其中的β-NGF会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。当加入生物素化的抗人β-NGF抗体后
，抗人β-NGF抗体与β-NGF接合

，形成夹心的免疫复合物




，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合

，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来

；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。最后加入显色剂，若样本中存在β-NGF将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质


，在加入终止液后呈黄色
。通过酶标仪检测
，读其450nm处的OD值
，β-NGF浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线



，对照未知样本中OD值
，即可算出标本中β-NGF浓度




。

人β-NGF定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作

；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可
；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清

，避免在冰箱中凝固血液
；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测
，

D.标本收集后请分装

，冻存于－20℃


，避免反复冻融
。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂

；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血
，高血脂或污染的标本检测
，否则结果将不准确

。

注：人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶
，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后

，剩余部份请丢弃


。

4.底物请勿接触氧化剂和金属
。

5.加样时
，请及时更换枪头


，避免交叉污染

。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份
。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要
，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀
。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的


，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔


。

11.加样过程中避免气泡的产生


。

12.血清和血浆标本的检测时
，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存

。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)
。

3.如有5x标准品稀释液
，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)。

4.标准品: 按标签复溶体积加入加入PH8.4 1%BSA复溶使β-NGF终浓度达到2000pg/ml


，室温反应，请严格控制在25～28℃
，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中



。（标准曲线取七个点

，最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板


：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒





。洗板5次
。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头

；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机

；                    

4.去离子水或双蒸水
；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃




。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液


。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线

。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中

，用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育120分钟。对于血清或血浆标本，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本, 如稀释量大


，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul
。   

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)

。用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育60分钟
。   

6.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)

。用封板胶纸封住反应孔
，避光室温（25～28℃）孵育20分钟
。

8.洗板5次

，且最后一次置厚吸水纸上拍干



。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟

。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD₄₅₀值
。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效
，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值



。

3.手工绘制标准曲线


。以标准品浓度作横坐标

，OD值作纵坐标

，以平滑线连接各标准品的坐标点
。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度
。

4.若标本OD值高于标准曲线上限

，应适当稀释后重测
，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

人β-NGF 参考标准曲线

注意
：本图仅供参考
，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量

。

灵敏度

，特异性和重复性:

1.灵敏度
：多次重复结果表明

，最小检出量为23pg/ml



。

2.特异性




：与人的BDNF





、 NT-3
、CNTF

、 NT-4和大鼠CNTF







、GDNF均没有交叉反应
，与小鼠的β-NGF交叉反应性为32.4%，与大鼠的β-NGF交叉反应性为2.7%.

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Einarsdottir, E. et al., 2004, Hum. Mol. Genet. 13: 799-805.

2. Brain. A. et al., 1999, J. Neurosci. 19: 8207-8218.

3. Pedraza, C. E. et al., 2005, Am. J. Pathol. 166: 53-543.

4. Ullrich, A. et al., 1983, Nature. 303: 821-825.