产品说明(可下载)人载脂蛋白E定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用 。用于体外定量检测人血清 、血浆或细胞培养上清液中的载脂蛋白E浓度 。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整 。如有产品包装破损或质量投拆 ，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。
载脂蛋白E简介：
载脂蛋白E，是一个低密度脂蛋白 ，极低密度脂蛋白 ，高密度脂蛋白及乳糜的基本构成蛋白，是一个糖蛋白。成熟的载脂蛋白E的分子量为34千道尔顿 。主要由肝细胞 ，巨噬细胞及神经系统中非神经细胞产生 。
载脂蛋白E能够抑制TNF-α ，Toll样受体3和Toll样受体4介导的炎症反应 ，刺激和调整T细胞及增强M2型巨噬细胞的抑制炎症作用 。载脂蛋白E在淀粉类代谢中起重要作用 ，在阿尔茨默氏病的发生中起重要作用。
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中载脂蛋白E的浓度 。载脂蛋白E捕获抗体已预包被于酶标板上 ，当加入标本或参考品时 ，其中的载脂蛋白E会与捕获抗体结合 ，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去 。当加入生物素化的抗人载脂蛋白E抗体后 ，抗人载脂蛋白E抗体与载脂蛋白E接合 ，形成夹心的免疫复合物 ，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去 。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合 ，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来 ；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂 ，若样本中存在载脂蛋白E将会形成免疫复合物 ，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质 ，在加入终止液后呈黄色 。通过酶标仪检测 ，读其450nm处的OD值 ，载脂蛋白E浓度与OD450值之间呈正比 ，通过参考品绘制标准曲线 ，对照未知样本中OD值 ，即可算出标本中载脂蛋白E浓度。
人载脂蛋白E定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分 | 规格（96T/48T） |
人载脂蛋白E预包被板 | 12条/6条 |
5×标准品稀释液 | 20ml/10ml |
人载脂蛋白E标准品 | 2/1支(冻干) |
人载脂蛋白E生物素化抗体 | 10ml/5ml |
亲和素连接的HRP酶 | 10ml/5ml |
浓缩洗涤液 20× | 30ml/15ml |
TMB底物 | 10ml/5ml |
中止液 | 5ml/3ml |
封板胶纸 | 3/2张 |
说明书 | 1份 |
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作；
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可 ；
B.血清标本应是自然凝固后，取上清 ，避免在冰箱中凝固血液 ；
C.血浆标本 ，推荐用EDTA的方法收集；
D.若待测样本不能及时检测 ，标本收集后请分装 ，冻存于－20℃ ，避免反复冻融 。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂 ；
3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除 。
4.请勿使用溶血 ，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2～8℃ 。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液 。
3.标准品复溶加样后 ，剩余部份请丢弃 。
4.底物请勿接触氧化剂和金属 。
5.加样时 ，请及时更换枪头 ，避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份 。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀 。
8.室温反应 ，请严格控制在25-28℃。
9.洗涤过程是至关重要的 ，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大 。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。
11.加样过程中避免气泡的产生 。
12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存 。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。
3.如有5X标准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水) 。
4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使载脂蛋白E终浓度达到4000pg/ml ，室温反应 ，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解 ，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中 。（标准曲线取七个点，最高浓度为4000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒 。洗板5次 。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干 。
实验过程需自备的材料 ：
1.不同规格的加样枪及相应的枪头 ；
2.酶标仪 ；
3.自动洗板机 ；
4.去离子水或双蒸水 ；
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数 ，取出所需板条放置在框架内 ，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封 ，保存于4℃ 。
2.建议设置本底较正孔 ，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线 。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中 ，用封板胶纸封住反应孔 ，室温（25-28℃）孵育120分钟 。血清血浆，1500~6000倍稀释 ，如无明确范围，可从3000倍开始。尿样无需稀释，细胞上清 ，1~15倍稀释，可从2倍开始 。
4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔) 。用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育60分钟。
6.洗板5次 ，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔) 。用封板胶纸封住反应孔 ，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。
8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔 ，避光室温（25-28℃）孵育20分钟 。
10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值 。
结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值 。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。
3.手工绘制标准曲线 。以标准品浓度作横坐标 ，OD值作纵坐标 ，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度 。
4.若标本OD值高于标准曲线上限 ，应适当稀释后重测 ，计算浓度时应乘以稀释倍数。
典型数值和参考曲线
浓度pg/ml | 典型OD值1 | 典型OD值2 | OD平均值 |
0 | 0.097 | 0.109 | 0.103 |
125 | 0.186 | 0.202 | 0.194 |
250 | 0.287 | 0.303 | 0.295 |
500 | 0.512 | 0.56 | 0.536 |
1000 | 0.858 | 0.89 | 0.874 |
2000 | 1.623 | 1.707 | 1.665 |
4000 | 2.941 | 3.085 | 3.013 |
人载脂蛋白E参考标准曲线
灵敏度 ，特异性和重复性:
1.灵敏度 ：多次重复结果表明 ，最小检出量为79.6pg/ml。
2.特异性 ：与人的ApoA1 、ApoA2 、ApoB 、ApoB100 、ApoC1 、ApoC2 、ApoD等没有交叉反应 。
3.重复性：板内 ，板间变异系数均<10%.
参考文献:
1. Mullick, A.E. et al. (2007) Arteriosescler. Throm. Vasc. Biol. 27:339
2. Perugini, M.A. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:36758.
3. Krimbou, L. et al. (2004) J. Lipid. Res. 45:839.
4. Baitsch, D. et al. (2011) Arteriosescler. Throm. Vasc. Biol. 31:1160.
5. Jones, P.B. et al. (2011) PLoS ONE 6:e14586.
6. Chroni, A. et al. (2005) Biochemistry 44:13132.
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