人胰岛素定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用






。用于体外定量检测人血清

、血浆或细胞培养上清液中的胰岛素浓度
。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆
，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。

胰岛素简介

：

胰岛素是糖代谢中最主要的激素之一。胰腺的ß细胞岛细胞产生胰岛素前体蛋白
，前体蛋白被加工成C肽和胰岛素。它们以等摩尔浓度进入血循环中。成熟的胰岛素由A、B两条链组成。这两条链是通过两个二硫键桥接形成有功能的胰岛素分子
。

血浆葡萄糖浓度的变化是胰岛素产生并分泌的最主要刺激因素
，产生的胰岛素具有一些代谢调节作用



。其最主要的作用是
，将外周血中糖转运到肝脏中贮存起来。一些诸如肝糖生成障碍或在促进血糖升高的激素诸如胰高血糖素、肾上腺素


、生长激素和皮质醇等作用下促进肝糖分解都可拮抗胰岛素的作用。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中胰岛素的浓度。胰岛素捕获抗体已预包被于酶标板上
，当同时加入标本或参考品和HRP耦连的抗人胰岛素抗体时，其中胰岛素的不同位点会与捕获抗体和HRP耦连的抗人胰岛素抗体结合，形成夹心复合物





，锚定在固相载体板上






，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去








。最后加入显色剂
，若样本中存在胰岛素将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质
，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测
，读其450nm处的OD值


，胰岛素浓度与OD450值之间呈正比



，通过参考品绘制标准曲线


，对照未知样本中OD值
，即可算出标本中胰岛素浓度
。

人胰岛素定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后
，取上清

，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测

，

D.标本收集后请分装
，冻存于－20℃

，避免反复冻融
。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明
，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除
。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测
，否则结果将不准确。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃





。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液
。

3.标准品复溶加样后



，剩余部分请丢弃
。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时






，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份

。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀
。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟
；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)

。

3.如有5x标准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)
。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使胰岛素终浓度达到200 mIU/L
，室温反应，请严格控制在25～28℃


，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解
，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中
。（标准曲线取七个点，最高浓度为200 mIU/L,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板







：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次

。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干




。

实验过程需自备的材料
：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头
；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机


；                     

4.去离子水或双蒸水
；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数




，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封
，保存于4℃



。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(25ul/孔)加入相应孔中，快速加入HRP连接抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔
，室温（25～28℃）孵育120分钟。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

5.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育10分钟。

6.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值





。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效
，复孔的值平均后可作为测量值
。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值


。

3.手工绘制标准曲线
。以标准品浓度作横坐标
，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点





。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度


。

4.若标本OD值高于标准曲线上限

，应适当稀释后重测

，计算浓度时应乘以稀释倍数

。

典型数值和参考曲线

人胰岛素参考标准曲线

注意
：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量


。

灵敏度
，特异性和重复性:

1.灵敏度
：多次重复结果表明，最小检出量为1.54mIU/L

。

2.特异性
：与人的C肽
，Proinsulin




，IGF-I


、IGF-II和大鼠胰岛素
、小鼠胰岛素不反应

，与猪、绵羊和牛的胰岛素分别有374%、48%和31%的交叉反应性
。

3.重复性


：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1、FRIER, B.M., ASHBY, J.P., NAIRIN, I.M. and BAIRS, J.D. (1981).Plasma insulin, C-peptide and glucagon concentrations in patients with insulin-independent diabetes treated with chlorpropamide. Diab. Metab.. 7, 1, 45-49.

2
、Rudovich NN, Rochlitz HJ, Pfeiffer AF. (2004) Reduced hepatic insulin extraction in response to gastric inhibitory polypeptide compensates for reduced insulin secretion in normal-weight and normal glucose tolerant first-degree relatives of type 2 diabetic patients. Diabetes 53:2359-2365

3


、JUDZEWITSCH, R.G., PFEIFER, M.A., BEST, J.D:, BEARD J.C., HALTER, J.B. and PORTE D. Jr. (1982). Chronic chlorpropamide therapy of noninsulin-dependent diabetes augments basal and stimulated insulin secretion by increasing islet sensitivity to glucose. J. Clin. End. And Metab. 55, 2, 321-328.

4
、Riserus U, Vessby B, Arner P, Zethelius B. (2004) Supplementation with trans10cis12-conjugated linoleic acid induces hyperproinsulinaemia in obese men: close association with impaired insulin sensitivity. Diabetologia 47:1016-1019

5


、Gaines-Das, R.E. and Bristow, A.F. (1988) WHO International reference reagents for human proinsulin and human C-peptide. J Biol Stand 16:179-186

6、 Lindstrom T, Hedman CA, Arnqvist HJ. (2002) Use of a novel double-antibody technique to describethe pharmacokinetics of rapid-acting insulin analogs. Diabetes Care 25:1049-1054