产品说明(可下载)巨噬细胞炎性蛋白1贝塔定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用 。用于体外定量检测人血清 、血浆或细胞培养上清液中的CCL4浓度 。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整 。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏 。
CCL4 简介 ：
巨噬细胞炎性蛋白β（ MIP-1β）属于cysteine-cysteine (cc)趋化因子家族，人MIP-1β前体蛋白含23个氨基酸残基编码的信号肽 ，切割掉信号肽后形成成熟的69个氨基酸残基的无糖基化的成熟蛋白 。
MIP-1β由活化的T细胞，B细胞，单核细胞及肥大细胞分泌 。无论CCL4和CCL3对单核蛋白都具有相似的效果 。但在对淋巴细胞的效应上却是不同的 ，CCL4只是选择性对CD4+的淋巴细胞起作用，而CCL3只对CD8+淋巴细胞起作用 。另外 ，CCL4和CCL3对B细胞 ，嗜酸性粒细胞及树突状细胞来说都是有效的化学诱导剂 。据报道 ，MIP-1β在相同细胞上的活性只有MIP-1α的二十分之一。
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中CCL4的浓度。CCL4捕获抗体已预包被于酶标板上 ，当加入标本或参考品时 ，其中的CCL4会与捕获抗体结合 ，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去 。当加入生物素化的抗人CCL4抗体后，抗人CCL4抗体与CCL4接合，形成夹心的免疫复合物 ，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去 。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合 ，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来 ；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂 ，若样本中存在CCL4将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色 。通过酶标仪检测 ，读其450nm处的OD值 ，CCL4浓度与OD450值之间呈正比 ，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值 ，即可算出标本中CCL4浓度 。
人CCL4定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分 | 规格（96T/48T） |
人CCL4预包被板 | 12条/6条 |
5×标准品稀释液 | 10ml/5ml |
人CCL4标准品 | 2支/1支(冻干) |
人CCL4生物素化抗体 | 10ml/5ml |
亲和素连接的HRP酶 | 10ml/5ml |
浓缩洗涤液 20× | 30ml/15ml |
TMB底物 | 10ml/5ml |
中止液 | 5ml/3ml |
封板胶纸 | 3/2张 |
说明书 | 1份 |
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作；
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可 ；
B.血清标本应是自然凝固后，取上清 ，避免在冰箱中凝固血液 ；
C.血浆标本 ，推荐用EDTA的方法收集
D.若待测样本不能及时检测 ，标本收集后请分装 ，冻存于－20℃，避免反复冻融 。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂 ；
3.标本应清澈透明 ，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2～8℃。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液 。
3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃 。
4.底物请勿接触氧化剂和金属 。
5.加样时 ，请及时更换枪头 ，避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份 。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要 ，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀 。
8.室温反应，请严格控制在25～28℃ 。
9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大 。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔 。
11.加样过程中避免气泡的产生。
12.血清和血浆标本的检测时 ，检测抗体的孵育时间应适当延长 。
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟 ；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存 。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水) 。
3. 将5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水) 。
4.标准品: 按标签复溶体积加入1X标准品稀释液复溶使CCL4终浓度达到500pg/ml ，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点 ，最高浓度为500 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul ，注入与吸出间隔15-30秒 。洗板5次 。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干 。
实验过程需自备的材料 ：
1.不同规格的加样枪及相应的枪头 ；
2.酶标仪 ；
3.自动洗板机 ；
4.去离子水或双蒸水 ；
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数 ，取出所需板条放置在框架内 ，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃ 。
2.建议设置本底较正孔 ，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中 ，用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟 。血清样本的稀释倍数一般2~10倍稀释，如无准确稀释范围，从2倍开始稀释 。细胞上清一般直接加样100μl ，如超出检测范围需根据实验情况稀释后再检测 。
4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔) 。用封板胶纸封住反应孔 ，室温（25-28℃）孵育60分钟。
6.洗板5次 ，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔) 。用封板胶纸封住反应孔 ，避光室温（25-28℃）孵育20分钟 。
8.洗板5次 ，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。
10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。
结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值 。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值 。
3.手工绘制标准曲线 。以标准品浓度作横坐标 ，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度 。
4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数 。
典型数值和参考曲线
浓度pg/ml | 典型OD值1 | 典型OD值2 | OD平均值 |
0 | 0.107 | 0.083 | 0.095 |
15.625 | 0.19 | 0.154 | 0.172 |
31.25 | 0.274 | 0.23 | 0.252 |
62.5 | 0.423 | 0.371 | 0.397 |
125 | 0.812 | 0.784 | 0.798 |
250 | 1.467 | 1.383 | 1.425 |
500 | 2.883 | 2.499 | 2.691 |
人CCL4 参考标准曲线
注意 ：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量 。
灵敏度，特异性和重复性:
1.灵敏度：多次重复结果表明 ，最小检出量为5.9pg/ml 。
2.特异性：与人的ANG 、EGF 、Epo 、FGF acidic 、HGF 、 IFN-γ 、 FGF basic 及小鼠的CCL4无交叉反应性 。
3.重复性 ：板内，板间变异系数均<10%.
参考文献:
1. Schall, T.J. (1991) Cytokine 3:165.
2. Graham, G.J. et al. (1990) Nature 344:442.
3. Neote, K. et al. (1993) Cell 72:415.
4. Oppenheim, J.J. et al. (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:617.
5. Murphy, P.M. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:593.
6. Schall, T.J. et al. (1993) J. Exp. Med. 177:1821.
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