人次级淋巴组织趋化因子定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用
。用于体外定量检测人血清
、血浆或细胞培养上清液中的CCL21浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏
。

CCL21简介



：

CCL21，也叫SLC（次级淋巴组织趋化因子）



、6Ckine 和 Exodus2，与CCL19有32%的同源性，与其它CC趋化因子有33%的同源性。人的CCL21 cDNA编码134个氨基酸残基的前体蛋白

，前体蛋白经过裂解形成成熟的具111个氨基酸的成熟蛋白
。

CCL21一般在淋巴组织如淋巴结


、脾及附属淋巴器官表面有大量的表达

。CCL21是幼稚T细胞和树突状细胞进入附属淋巴器官的强烈调控剂


。CCL21也在T细胞的激活中有重要的作用
，同时具有招募淋巴细胞进入炎性组织的作用。CCL21被认为是第一个参与体内淋巴细胞归巢( Lymphocyte homing )的趋化因子
。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中CCL21的浓度

。CCL21捕获抗体已预包被于酶标板上
，当加入标本或参考品时

，其中的CCL21会与捕获抗体结合

，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人CCL21抗体后

，抗人CCL21抗体与CCL21接合，形成夹心的免疫复合物


，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去





。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合

，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来

；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。最后加入显色剂，若样本中存在CCL21将会形成免疫复合物
，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质


，在加入终止液后呈黄色

。通过酶标仪检测

，读其450nm处的OD值
，CCL21浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中CCL21浓度
。

人CCL21定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作
；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可
；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，

D.标本收集后请分装

，冻存于－20℃

，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂
；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除

。

4.请勿使用溶血
，高血脂或污染的标本检测

，否则结果将不准确



。

注
：人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测
。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液

。

3. 标准品复溶加样后


，剩余部份请丢弃

。

4
、底物请勿接触氧化剂和金属。

5






、加样时，请及时更换枪头


，避免交叉污染
。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份
。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要
，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应

，请严格控制在25～28℃
。

9.洗涤过程是至关重要的


，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔
。

11.加样过程中避免气泡的产生
。

12、血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长

。

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟
；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)
。

3.如有5X准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使CCL21终浓度达到4000pg/ml
，室温反应


，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点
，最高浓度为4000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法: 

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul

，注入与吸出间隔15-30秒

。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干
。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪



；

3．自动洗板机
；                    

4．去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内



，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封

，保存于4℃


。

2.建议设置本底较正孔



，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线
。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔

，室温（25～28℃）孵育120分钟
。对于血清或血浆标本，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本




，如稀释量大
，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul



。     

4.洗板5次




，且最后一次置厚吸水纸上拍干

。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育60分钟



。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)
。用封板胶纸封住反应孔


，避光室温（25～28℃）孵育20分钟。

8.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干

。

9.加入显色剂TMB100ul/孔
，避光室温（25～28℃）孵育20分钟
。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值



。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效
，复孔的值平均后可作为测量值
。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标



，OD值作纵坐标
，以平滑线连接各标准品的坐标点

。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限
，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数
。

典型数值和参考曲线

人 CCL21 参考标准曲线

注意：本图仅供参考
，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量




。

灵敏度
，特异性和重复性:

1.灵敏度



：多次重复结果表明
，最小检出量为54pg/ml。

2.特异性

：与小鼠 6Ckine等没有交叉反应



。

3.重复性

：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1
、Christopherson,K.W. et al., 2001, Blood. 98 (13):3562-8.

2
、Clark H.F., et al., 2003, Genome Res. 13: 2265-2270.

3、Ashour,A.E. et al., 2007, Cancer Biol Ther. 6 (8):1206-10.

4
、Mumtaz,M. et al., 2009, Oncol Rep. 21 (1):153-8.