人角蛋白生长因子定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用


。用于体外定量检测人血清
、血浆或细胞培养上清液中的KGF浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整

。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。

KGF简介:

角蛋白生长因子1(KGF-1/FGF-7)是一个具有两个保守半胱氨酸残基的

，肝磷脂结合的单链糖蛋白


，分子量为28 kDa。是已知FGF家族23个成员中的一员



。成熟的KGF的全长是163个氨基酸残基
，含5个半胱氨酸
。

KGF主要由成纤维细胞、胚胎间叶细胞和平滑肌细胞所分泌。

KGF的主要功能是刺激细胞的增殖和分化。KGF是上皮细胞和角化细胞的特异性的有丝分裂刺激因子，此外
，它还能介导细胞增殖
、同时也可以刺激上皮细胞的分化
。在创伤愈合组织中
，当一些促炎性分子 破坏组织后，KGF家族的蛋白可作为上皮细胞的修复剂而起保护作用
。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中KGF的浓度。KGF捕获抗体已预包被于酶标板上

，当加入标本或参考品时，其中的KGF会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。当加入生物素化的抗人KGF抗体后，抗人KGF抗体与KGF接合
，形成夹心的免疫复合物
，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去

。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合
，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来


；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。最后加入显色剂



，若样本中存在KGF将会形成免疫复合物
，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质
，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，KGF浓度与OD₄₅₀值之间呈正比
，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值
，即可算出标本中KGF浓度
。

人KGF定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作



；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后
，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，

D.标本收集后请分装
，冻存于－20℃，避免反复冻融


。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂

；

3.标本应清澈透明



，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除
。

4.请勿使用溶血
，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确

。

注
：人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃

。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶






，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液
。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属


。

5.加样时，请及时更换枪头


，避免交叉污染

。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份
。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要
，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀




。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃
。

9.洗涤过程是至关重要的




，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时
，检测抗体的孵育时间应适当延长
。

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存
。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5X准品稀释液




，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)
。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使KGF终浓度达到2000pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃


，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解
，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板

：每孔洗涤液为300ul
，注入与吸出间隔15-30秒
。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料
：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头


；   

2.酶标仪



；

3.自动洗板机


；                     

4.去离子水或双蒸水
；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封
，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液
。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中



，用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育120分钟
。对于血清或血浆标本


，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本, 如稀释量大
，请将样本与样本分析缓冲液等量加入
，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。  

4.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔


，室温（25～28℃）孵育60分钟


。    

6.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干

。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔

，避光室温（25～28℃）孵育20分钟


。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

9.加入显色剂TMB100ul/孔
，避光室温（25～28℃）孵育20分钟
。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD₄₅₀值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效

，复孔的值平均后可作为测量值


。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值

。

3.手工绘制标准曲线

。以标准品浓度作横坐标

，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点


。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度
。

4.若标本OD值高于标准曲线上限

，应适当稀释后重测



，计算浓度时应乘以稀释倍数

。

典型数值和参考曲线

人KGF 参考标准曲线

注意
：本图仅供参考

，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量
。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度



：多次重复结果表明

，最小检出量为16.2pg/ml
。

2.特异性
：与FGF-4、FGF-5、FGF-6

、FGF acidic等没有交叉反应。

3.重复性
：板内
，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Fernig, D.G. and J.T. Gallagher (1994) Prog. Growth Factor Res. 5:353.

2. Lovec, H. et al. (1997) Cytogenet. Cell Genet. 76:183.

3. Matsubara, Y. et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 222:669.

4. Mansukhani, A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3305.

5. Zhou, Y. et al. (1996) Exp. Dermatol. 5:138.

6. Gil Diez de Medina, S. et al. (1997) Oncogene 14:323.