产品说明(可下载)人的金属蛋白酶组织抑制因子定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用 。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的TIMP-1浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整 。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏 。
TIMP-1简介 ：
金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）是MMPs家族的组织抑制剂 ，广泛分布于组织和体液中 ，共价结合MMPs而抑制其活性。TIMPs 家族有四个蛋白，TIMP1 、 TIMP2 、 TIMP3 和TIMP4， TIMP-1是一种可由许多不同种类细胞产生的分子量为28KD的糖蛋白 ，是一种重要的MMPs的抑制剂，与MMPs的酶原或活化后酶的催化区的羧基末端特异性结合 ，形成复合物 ，从而特异性抑制MMPs的水解活性 。除了抑制MMPs外 ，TIMP-1在组织动态平衡中也起重要的作用
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中TIMP-1的浓度。TIMP-1捕获抗体已预包被于酶标板上 ，当加入标本或参考品时 ，其中的TIMP-1会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人TIMP1抗体后 ，抗人TIMP-1抗体与TIMP-1接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合 ，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在TIMP1将会形成免疫复合物 ，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质 ，在加入终止液后呈黄色 。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，TIMP-1浓度与OD450值之间呈正比 ，通过参考品绘制标准曲线 ，对照未知样本中OD值 ，即可算出标本中TIMP-1浓度 。
人TIMP-1定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:
组分 | 规格（96T/48T） |
人TIMP-1预包被板 | 12条/6条 |
5X标准品稀释液 | 10ml/5ml |
人TIMP-1标准品 | 2支/1支(冻干) |
人TIMP-1生物素化抗体 | 10ml/5ml |
亲和素连接的HRP酶 | 10ml/5ml |
浓缩洗涤液 20× | 30ml/15ml |
TMB底物 | 10ml/5ml |
中止液 | 5ml/3ml |
封板胶纸 | 3/2张 |
说明书 | 1份 |
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作 ；
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可 ；
B.血清标本应是自然凝固后 ，取上清，避免在冰箱中凝固血液 ；
C.血浆标本 ，推荐用EDTA的方法收集；
D.标本收集后请分装 ，若待测样本不能及时检测 ，冻存于－20℃ ，避免反复冻融 。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂 ；
3.标本应清澈透明 ，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除 。
4.请勿使用溶血 ，高血脂或污染的标本检测 ，否则结果将不准确 。
注 ：人血清或血浆样本请用标准品稀释液稀释后再检测 。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2～8℃ 。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃 。
4.底物请勿接触氧化剂和金属。
5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份 。
7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀 。
8.室温反应 ，请严格控制在25~28℃。
9.洗涤过程是至关重要的 ，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔 。
11.加样过程中避免气泡的产生。
12.血清和血浆标本的检测时 ，检测抗体的孵育时间应适当延长。
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25~28℃）平衡20分钟 ；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存 。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水) 。
3.如有5x标准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水) 。
4.标准品: 按标签复溶体积加入1X标准品稀释液复溶使TIMP-1终浓度达到2000pg/ml ，室温反应 ，请严格控制在25～28℃ ，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中 。（标准曲线取七个点 ，最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板 ：每孔洗涤液为300ul ，注入与吸出间隔15-30秒 。洗板5次 。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干 。
实验过程需自备的材料 ：
1.不同规格的加样枪及相应的枪头 ；
2.酶标仪 ；
3.自动洗板机 ；
4.去离子水或双蒸水 ；
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数 ，取出所需板条放置在框架内 ，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封 ，保存于4℃ 。
2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液 。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线 。
3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中 ，用封板胶纸封住反应孔 ，室温（25~28℃）孵育120分钟 。如果是血清血浆样本 ，不同样本稀释比例不一样 ，一般范围在50~500倍 ，如无明确范围，建议从200倍稀释 ，如果样本浓度过高 ，超过检测范围 ，请加大稀释倍数后重新稀释检测。
4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔) 。用封板胶纸封住反应孔 ，室温（25~28℃）孵育60分钟 。
6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔) 。用封板胶纸封住反应孔 ，避光室温（25~28℃）孵育20分钟 。
8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干 。
9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25~28℃）孵育20分钟 。
10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值 。
结果判断:
1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值 。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值 。
3.手工绘制标准曲线 。以标准品浓度作横坐标 ，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点 。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度 。
4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测 ，计算浓度时应乘以稀释倍数。
典型数值和参考曲线
浓度pg/ml | 典型OD值1 | 典型OD值2 | OD平均值 |
0 | 0.0701 | 0.0908 | 0.0842 |
61.25 | 0.2201 | 0.2635 | 0.2418 |
125 | 0.4478 | 0.48 | 0.4639 |
250 | 0.9274 | 0.8156 | 0.8715 |
500 | 1.2827 | 1.2437 | 1.2632 |
1000 | 1.7025 | 1.7751 | 1.7388 |
2000 | 2.1224 | 2.2568 | 2.1896 |
人TIMP-1参考标准曲线
注意 ：本图仅供参考 ，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量 。
灵敏度 ，特异性和重复性:
1.灵敏度 ：多次重复结果表明 ，最小检出量为28pg/ml 。
2.特异性 ：与人MMP-1,MMP-3,MMP-2 ,IMP-2和小鼠TIMP-1等没有交叉反应 。
3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.
参考文献:
1. Bode, W. et al. (1999) Cell Mol. Life Sci. 55:639.
2. Bode, W. et al. (1999) APMIS 107:3.
3. Kolkenbrok, H. et al. (1995) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 376:495.
上海尊龙凯时人生就是搏生物科技有限公司
