大鼠胰岛素定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用

。用于体外定量检测大鼠血清
、血浆或细胞培养上清液中的胰岛素浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。

胰岛素简介



：

胰岛素是糖代谢中最主要的激素之一
。胰腺的ß细胞岛细胞产生胰岛素前体蛋白
，前体蛋白被加工成C肽和胰岛素。它们以等摩尔浓度进入血循环中。成熟的胰岛素由A
、B两条链组成
。这两条链是通过两个二硫键桥接形成有功能的胰岛素分子。

血浆葡萄糖浓度的变化是胰岛素产生并分泌的最主要刺激因素



，产生的胰岛素具有一些代谢调节作用。其最主要的作用是，将外周血中糖转运到肝脏中贮存起来


。一些诸如肝糖生成障碍或在促进血糖升高的激素诸如胰高血糖素、肾上腺素


、生长激素和皮质醇等作用下促进肝糖分解都可拮抗胰岛素的作用。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中胰岛素的浓度。胰岛素捕获抗体已预包被于酶标板上，当同时加入标本或参考品和HRP耦连的抗大鼠胰岛素抗体时，其中胰岛素的不同位点会与捕获抗体和HRP耦连的抗大鼠胰岛素抗体结合，形成夹心复合物

，锚定在固相载体板上



，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去

。最后加入显色剂

，若样本中存在胰岛素将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质
，在加入终止液后呈黄色
。通过酶标仪检测




，读其450nm处的OD值，胰岛素浓度与OD450值之间呈正比
，通过参考品绘制标准曲线


，对照未知样本中OD值


，即可算出标本中胰岛素浓度。

 大鼠胰岛素定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作


；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可



；

B.血清标本应是自然凝固后
，取上清
，避免在冰箱中凝固血液

；

C.血浆标本

，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测
，

D.标本收集后请分装
，冻存于－20℃，避免反复冻融

。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂




；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除
。

4.请勿使用溶血
，高血脂或污染的标本检测


，否则结果将不准确。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃




。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶
，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后
，剩余部分请丢弃

。

4.底物请勿接触氧化剂和金属
。

5.加样时
，请及时更换枪头

，避免交叉污染

。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要


，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀
。

8.室温反应



，请严格控制在25～28℃



。

9.洗涤过程是至关重要的



，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生









。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作: 

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5X准品稀释液
，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)
。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使胰岛素终浓度达到5.5ng/ml
，室温反应
，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解

，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中
。（标准曲线取七个点，最高浓度为5.5ng/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或大鼠工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干
。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头

；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机
；                     

4.去离子水或双蒸水
；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数

，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封
，保存于4℃


。

2.建议设置本底较正孔
，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液





。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线
。

3.分别将标本或不同浓度标准品(10ul/孔)加入相应孔中，快速加入HRP连接抗体工作液(100ul/孔)
。用封板胶纸封住反应孔


，室温（25～28℃）孵育120分钟

。

4.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

5.加入显色剂TMB100ul/孔

，避光室温（25～28℃）孵育20分钟

。

6.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值

。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标


，OD值作纵坐标


，以平滑线连接各标准品的坐标点


。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度
。

4.若标本OD值高于标准曲线上限
，应适当稀释后重测
，计算浓度时应乘以稀释倍数
。

典型数值和参考曲线

大鼠胰岛素参考标准曲线

注意：本图仅供参考
，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度

，特异性和重复性:

1.灵敏度




：多次重复结果表明

，最小检出量为0.1ng/ml


。

2.特异性

：不与IGF-I、IGF-II

、 小鼠 C肽

、大鼠 C肽反应

，与猪胰岛素、绵羊胰岛素、小鼠胰岛素



、牛胰岛素及人胰岛素分别有628%
，256%，75%，110%和195%交叉反应。

3.重复性



：板内
，板间变异系数均<10%.

参考文献:

Korner J, Savontaus E, Chua SC, Jr., Leibel RL, Wardlaw SL (2001) Leptin regulation of Agrp and Npy mRNA in the rat hypothalamus. J Neuroendocrinol 13:959-966

Olsson R and Carlsson PO (2005) Better vascular engraftment and function in pancreatic islets transplanted without prior culture. Diabetologia 48:469-476

Rydtren T and Sandler S (2002) Efficacy of 1400 W, a novel inhibitor of inducible nitric oxide synthase, in preventing interleukin-1beta-induced suppression of pancreatic islet function in vitro and multiple low-dose

streptozotocin-induced diabetes in vivo. Eur J Endocrinol 147:543- 551 10