大鼠白细胞介素17A定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用
。用于体外定量检测大鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-17A浓度






。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,如有产品包装破损或质量投拆


，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。

IL-17A简介：

白介17A，一类新的细胞因子家族，一般是由一个二硫键连接的同型二聚体。每个肽链含有155个氨基酸残基，分子量约为17.5kDa。白介17家族共有六个成员
，其中具同型二聚体结构


，分子量约为32kDa的白介17A主要由活化的T记忆细胞产生，刺激机体的免疫
。

许多证据都表明IL-17A具有调控免疫反应的功能。IL-17A调控T细胞造血系统细胞间的通讯已被证明

。T细胞产生的IL-17A通过NF-κB通路的作用
，诱导成纤维细胞产生IL-6, IL-8, ICAM-1 和G-CSF等细胞因子

。IL-17A也可通过刺激T细胞来提高T细胞本身的扩增和提高在骨关节炎患者软骨中NO水平的增高。

最近的研究表明
，IL-17A家族的细胞因子在炎症性疾病

、自身免疫病和肿瘤等发生中均有重要的作用
。几种如气管炎、类风湿性关节炎
、腹膜炎引起的粘连和脓肿
、肠炎、异体移植
、牛皮癣


、肿瘤和几种硬皮病等疾病中都检测出IL-17A表达水平的提高

。IL-17A调节通路在关节软骨、骨
、半月板
、脑
、造血组织、肾、肺、皮肤和肠中都起着重要的作用，表明IL-17在这类组织中不仅是免疫作用


，而且在该类组织的正常和病态的平衡间扮演一个重要的作用。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中大鼠IL-17A的浓度
。大鼠IL-17A捕获抗体已预包被于酶标板上

，当加入标本或参考品时，其中的大鼠IL-17A会与捕获抗体结合

，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去

。当加入生物素化的抗大鼠IL-17A抗体后
，抗大鼠IL-17A抗体与大鼠IL-17A接合

，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素
。生物素与亲合素特异性结合
，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。最后加入显色剂
，若样本中存在IL-17A将会形成免疫复合物



，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质

，在加入终止液后呈黄色
。通过酶标仪检测


，读其450nm处的OD值，大鼠IL-17A浓度与OD₄₅₀值之间呈正比
，通过参考品绘制标准曲线
，对照未知样本中OD值，即可算出标本中大鼠IL-17A浓度
。

大鼠IL-17A定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作
；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后
，取上清
，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集

；

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装

，冻存于 -20℃，避免反复冻融



。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂






；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除

。

4.请勿使用溶血

，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确
。

注：大鼠血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液
。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃


。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份
。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要



，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应
，请严格控制在25-28℃
。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔
。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时



，检测抗体的孵育时间应适当延长
。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟
；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存
。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5X准品稀释液

，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)

。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使IL-17A终浓度达到200pg/ml


，室温反应




，请严格控制在25～28℃
，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为200 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板
：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒
。洗板5次
。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料


：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机


；                     

4.去离子水或双蒸水



；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数

，取出所需板条放置在框架内

，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封
，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔



，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中
，用封板胶纸封住反应孔
，室温（25～28℃）孵育120分钟

。对于血清或血浆标本，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本, 如稀释量大
，请将样本与样本分析缓冲液等量加入
，不足部分用标准品稀释液补充至100ul



。     

4.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干





。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔
，室温（25～28℃）孵育60分钟
。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素链接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔
，避光室温（25～28℃）孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干
。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟




。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD₄₅₀值
。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效



，复孔的值平均后可作为测量值
。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值





。

3.手工绘制标准曲线


。以标准品浓度作横坐标
，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度
。

4.若标本OD值高于标准曲线上限
，应适当稀释后重测


，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

大鼠IL-17A参考标准曲线

注意：本图仅供参考



，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量



。

灵敏度







，特异性和重复性:

1.灵敏度





：多次重复结果表明
，最小检出量为1.8pg/ml

。

2.特异性
：与人IFN-γ和大鼠IFN-γ没有交叉反应。

3.重复性：板内

，板间变异系数均<10%.

参考文献：

 uziel and Greene, 1990  J. Invest. Dermatol., 94:275

 Parkinson et al., 1988  J.  Immunol. Methods, 15:105