大鼠伽马干扰素定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用



。用于体外定量检测大鼠血清




、血浆或细胞培养上清液中的IFN-γ浓度
。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏

。

IFN-γ简介

：

被称为II型干扰素的IFN-γ

，是由143个残基构成的，有20和25kDa亚型的糖蛋白


，以头尾相连的同型糖蛋白的形式存在。IFN-γ由T淋巴细胞和NK细胞产生


，用以抗病毒和干扰增殖
，此外
，IFN-γ还有与免疫调节相关的几种功能包括调节细胞的增殖和程序性死亡

，刺激或抑制不同基因的表达


。

IFN-γ能通过诱导产生吲哚胺2，3-双加氧酶来抗弓形虫和衣原体的感染。IFN-γ是效应强烈的单核吞噬细胞增强剂
，IFN-γ是通过增强单核吞噬细胞的的Mac-1的表达来达到增强胞饮作用和吞噬作用的。IFN-γ通过增加巨噬细胞的氧自由基和TNF-α的释放来达到增强杀肿瘤细胞的作用。IFN-γ选择性地提高包括因LPS刺激的B细胞的IgG2a和因2型T细胞呈递抗原而引起的B细胞的IgG3的释放量。有报道称IFN-γ能引起细胞的自分泌IFN-γ作用的增强
。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中大鼠IFN-γ的浓度。大鼠IFN-γ捕获抗体已预包被于酶标板上

，当加入标本或参考品时




，其中的大鼠IFN-γ会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗大鼠IFN-γ抗体后
，抗大鼠IFN-γ抗体与大鼠IFN-γ接合

，形成夹心的免疫复合物


，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去



。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素
。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来



；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去


。最后加入显色剂

，若样本中存在IFN-γ将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质





，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测
，读其450nm处的OD值
，大鼠IFN-γ浓度与OD₄₅₀值之间呈正比
，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中大鼠IFN-γ浓度。

大鼠IFN-γ定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作
；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可




；

B.血清标本应是自然凝固后
，取上清，避免在冰箱中凝固血液
；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集

；

D.若待测样本不能及时检测

，标本收集后请分装


，冻存于－20℃
，避免反复冻融


。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂


；

3.标本应清澈透明
，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血
，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确

。

注



：大鼠血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶
，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液
。

3.标准品复溶加样后

，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时
，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要


，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀
。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃
。

9.洗涤过程是至关重要的

，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大

。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔







。

11.加样过程中避免气泡的产生
。

12.血清和血浆标本的检测时




，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25～28℃）平衡20分钟

；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存
。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)


。

3.如有5X准品稀释液，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)


。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使大鼠IFN-γ终浓度达到2500pg/ml，室温反应
，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中


。（标准曲线取七个点，最高浓度为2500 pg/m l,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板
：每孔洗涤液为300ul
，注入与吸出间隔15-30秒
。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数

，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封
，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔
，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线
。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中

，用封板胶纸封住反应孔


，室温（25～28℃）孵育120分钟
。对于血清或血浆标本

，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，如稀释量大
，请将样本与样本分析缓冲液等量加入
，不足部分用标准品稀释液补充至100ul
。   

4.洗板5次


，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25～28℃）孵育60分钟。    

6.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干




。

7.加入亲和素链接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔
，避光室温（25～28℃）孵育20分钟
。

8.洗板5次


，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25～28℃）孵育20分钟。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值

。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效


，复孔的值平均后可作为测量值



。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线
。以标准品浓度作横坐标


，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点









。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限
，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

大鼠 IFN-γ参考标准曲线

注意
：本图仅供参考

，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为29pg/ml

。

2.特异性
：与GDNF, TNF-α,IL-1α,IL-1β,IL-2 ,IL-4 ,PDGF-BB, IL-10,人IFN-γ,小鼠  IFN-γ没有交叉反应


。

3.重复性
：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献
：

1. Paludan, S.R. (1998) Scand. J. Immunol. 48:459.

2. Yeaman, G.R. et al. (1998) J. Immunol. 160:5145.

3. Puddu, P. et al. (1997) J. Immunol. 159:3490.

4. Pestka, S. et al. (1997) Cytokine Growth Factor Rev. 8:189.

5. Lortat-Jacob, H. et al. (1991) J. Clin. Invest. 87:878.