大鼠白细胞介素6定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用
。用于体外定量检测大鼠血清

、血浆或细胞培养上清液中的IL-6浓度
。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整,如有产品包装破损或质量投拆

，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏。

IL-6简介

：

白介素6（IL-6）是一类多功能的蛋白

，在宿主防御，急性期反应

，免疫反应
，造血功能

，神经系统等方面起到重要的作用

。根据来源不同
，白介素6分子量从21到28kDa不同
，但均为单链蛋白
。白介素6在多种细胞中都有表达，如T细胞
、巨噬细胞

、纤维原细胞、肝细胞






、血管内皮细胞等

。由于IL-6具有不同的活性，所以IL-6也被称为干扰素β2(IFN-β2)、B细胞刺激因子-2(BSF-2)

、杂交瘤细胞生长因子

、肝细胞刺激因子
、毒性T细胞分化因子


、巨噬细胞粒细胞诱导因子(MGI-2A)等


。白细胞介素6在B-细胞向Ig分泌细胞的转化过程起到重要的作用，参与了淋巴细胞和单核细胞的分化
，诱导神经细胞在B-细胞
，T-细胞，肝细胞，造血干细胞以及中枢神经系统的分化作用


。此外
，肌肉运动收缩作用后白细胞介素6会被释放到血液中，进而能促进脂肪的分解并改善机体的胰岛素耐受性
。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中大鼠IL-6的浓度
。大鼠IL-6捕获抗体已预包被于酶标板上

，当加入标本或参考品时，其中的大鼠IL-6会与捕获抗体结合

，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗大鼠IL-6抗体后
，抗大鼠IL-6抗体与大鼠IL-6接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素


。生物素与亲合素特异性结合

，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。最后加入显色剂，若样本中存在IL-6将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质

，在加入终止液后呈黄色
。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值
，大鼠IL-6浓度与OD₄₅₀值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线


，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-6浓度
。

大鼠IL-6定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可


；

B.血清标本应是自然凝固后

，取上清

，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本



，推荐用EDTA的方法收集；D.若待测样本不能及时检测
，标本收集后请分装



，冻存于－20℃
，避免反复冻融
。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂


；

3.标本应清澈透明
，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血



，高血脂或污染的标本检测
，否则结果将不准确

。

注


：大鼠血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测


。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃
。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶

，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后
，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头


，避免交叉污染


。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要
，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀
。

8.室温反应
，请严格控制在25～28℃

。

9.洗涤过程是至关重要的
，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大
。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生

。

12.血清和血浆标本的检测时




，检测抗体的孵育时间应适当延长




。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25～28℃)平衡20分钟


；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5X准品稀释液
，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)
。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使大鼠IL-6终浓度达到8000pg/ml


，室温反应



，请严格控制在25～28℃


，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中
。（标准曲线取七个点

，最高浓度为8000 pg/m l,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板
：每孔洗涤液为300ul


，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次
。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数
，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封


，保存于4℃


。

2.建议设置本底较正孔

，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液



。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线


。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温(25～28℃)孵育120分钟

。对于血清或血浆标本，请加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本
，如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul
。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)
。用封板胶纸封住反应孔，室温(25～28℃)孵育60分钟。

6.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入板胶纸封住反应孔
，避光室温(25～28℃)孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔



，避光室温(25～28℃)孵育20分钟。

10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD₄₅₀值
。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效
，复孔的值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值


。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标

，OD值作纵坐标



，以平滑线连接各标准品的坐标点

。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度

。

4.若标本OD值高于标准曲线上限
，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

大鼠IL-6参考标准曲线

注意：本图仅供参考
，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度

，特异性和重复性:

1.灵敏度
：多次重复结果表明，最小检出量为67pg/ml
。

2.特异性



：与GDNF,GM-CSF,IFN-γ,IL-1α,IL-1β,IL-2 ,IL-4,IL-10,PDGF-BB,TNF-α,人 IL-6,小鼠 IL-6

没有交叉反应

。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Hirano, T. (1998) "Interleukin 6" in The Cytokine Handbook, 3rd. ed. Academic Press, New York, p. 197.

2. Taga, T. and T. Kishimoto (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:797.

3. Chiu, C-P. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7099.

4. Peters, M. et al. (1998) Blood 92:3495.