人的骨形成蛋白9定量分析酶联免疫检测试剂盒

本试剂盒仅供科研使用
。用于体外定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的BMP-9浓度。使用前请仔细阅读说明书并检查试剂组分是否完整
。如有产品包装破损或质量投拆，请在收到货一个月之内联系尊龙凯时人生就是搏
。

BMP-9简介

：

人的BMP-9，也称为GDF-2，是属于TGF家族的一种细胞因子

。人BMP-9的cDNA编码429个氨基酸的前体蛋白

，而后经过裂解生成22个氨基酸的信号肽及298个氨基酸的多肽和110个氨基酸的多肽
，人的BMP-9是两个分子量为24.1 kDa 
，110个氨基的多肽经过二硫键连接形成有活性的二聚体蛋白

。

人的BMP-9主要在肝脏中由非实质细胞生成

，能够刺激脂代谢和抑制葡萄糖的产生

，此外




，BMP-9也被证明在多种生理过程中起作用，包括调控肝脏的网状内皮系统的平衡，葡萄糖的动态平衡、铁的动态平衡以及抵制血管的发生等。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中BMP-9的浓度

。BMP-9捕获抗体已预包被于酶标板上
，当加入标本或参考品时


，其中的BMP-9会与捕获抗体结合

，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去
。当加入生物素化的抗人BMP-9抗体后
，抗人BMP-9抗体与BMP-9接合，形成夹心的免疫复合物


，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去


。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素
。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去

。最后加入显色剂
，若样本中存在BMP-9将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测
，读其450nm处的OD值，BMP-9浓度与OD₄₅₀值之间呈正比
，通过参考品绘制标准曲线

，对照未知样本中OD值，即可算出标本中BMP-9浓度。

人BMP-9定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作
；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可
；

B.血清标本应是自然凝固后

，取上清




，避免在冰箱中凝固血液

；

C.血浆标本
，推荐用EDTA的方法收集
；

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装

，冻存于－20℃

，避免反复冻融

。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除

。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测
，否则结果将不准确

。

注：人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃
。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶

，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液
。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时

，请及时更换枪头



，避免交叉污染

。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份




。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要


，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应
，请严格控制在25～28℃
。

9.洗涤过程是至关重要的
，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大

。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生
。

12.血清和血浆标本的检测时
，检测抗体的孵育时间应适当延长
。

检测前准备工作:

1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3.如有5X准品稀释液

，请按所需量用双蒸水或去离子水稀释(1份加4水)。

4.标准品: 按标签复溶体积加入标准品稀释液复溶使BMP-9终浓度达到1000pg/ml，室温反应



，请严格控制在25～28℃，静置10~15分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解
，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中
。（标准曲线取七个点，最高浓度为1000pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板
：每孔洗涤液为300ul
，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次
。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干



。

实验过程需自备的材料
：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头


；   

2.酶标仪
；

3.自动洗板机


；                     

4.去离子水或双蒸水
；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数
，取出所需板条放置在框架内

，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔

，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线

。

3.分别将标本或不同浓度标准品(100ul/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔
，室温（25-28℃）孵育120分钟
。对于血清或血浆标本，请加入50ul样本分析缓冲液后加50ul标本

，如稀释量大




，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul

。    

4.洗板5次


，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)

。用封板胶纸封住反应孔

，室温（25-28℃）孵育60分钟。

6.洗板5次






，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟


。

8.洗板5次
，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入TMB底物100ul/孔
，避光室温（25-28℃）孵育20分钟

。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值
。

结果判断:

1.复孔的值在20%的差异范围内结果才有效


，复孔的值平均后可作为测量值





。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值
。

3.手工绘制标准曲线
。以标准品浓度作横坐标
，OD值作纵坐标

，以平滑线连接各标准品的坐标点




。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度
。

4.若标本OD值高于标准曲线上限
，应适当稀释后重测

，计算浓度时应乘以稀释倍数
。

典型数值和参考曲线

人BMP-9参考标准曲线

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量

。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度


：多次重复结果表明
，最小检出量为16pg/ml
。

2.特异性












：与人的BMP-3，BMP-4，BMP-5


、BMP-6

、BMP-7、BMP-10

、TGF-β1、TGF-β2

、TGF-β3均无交反应
，能识别小鼠的BMP-9。

3.重复性






：板内
，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Chen, C. et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21:294.

2. Miyazono, K. et al. (2005) Cytokine Growth Factor Rev. 16:251.

3. Majumdar, M.K. et al. (2001) J. Cell. Physiol. 189:275.

4. Brown, M.A. et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:25111.

5. LopezCoviella, I. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. 102:6984.

6. Miller, A.F. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:17937.