干细胞冻存是干细胞扩增传代过程中重要的一环，但是干细胞不同于普通细胞系
，其增殖扩增过程中需要聚团生长，为保持其细胞活性
，不建议单细胞传代
。而且使用血清+DMSO冻存方法，不能很好的保持细胞活性，且复苏细胞成活率较低。这次就重点介绍干细胞进行冻存以及解冻的标准化步骤
。

　　本方法适用于HAKATA™ 人间充质干细胞无血清培养基以及HAKATA™ 无血清细胞冻存液培养的细胞（同样适用于mTesR以及E8系统培养的细胞），冻存以及复苏前后，应当使用同一种培养基，复苏传代后可以更换其他培养体系。

HAKATA™ 无血清细胞冻存液是尊龙凯时人生就是搏生物独家研制的的一款化学成分确定，无血清，无动物源成分，且无需程序降温的高效冻存液。具体冻存及复苏操作方法如下：

1
、冻存
：以下操作方法以6孔板为例：

　　注意：如果使用mFreSR™
，请将所需量的mFreSR™融化并置于冰上。

　　（1） HAKATA™ 无血清细胞冻存液为即拿即用，且4℃保存，冻存液拿出后应快速放回4℃；

　　（2）使用干细胞消化液消化细胞；

（3）收集细胞，室温300×g离心5分钟；

　　（3）小心吸掉上清液
，不要干扰细胞团

；

　　（4）用1ml冻存液重悬细胞，并均匀分装到冻存管中

　　采用非程序降温法，将冻存管直接放入-80℃冰箱中，冻存24h后转移至液氮中长期保存。　　

　　2
、解冻

　　预先包被细胞培养板，人ES和iPS细胞解冻后应立即接种到培养板中。

　　（1）干细胞培养基室温平衡15-30min,不能37℃加热; 　　

（2）在水浴锅中持续晃动冻存管，37℃水浴锅中快速解冻细胞
，直至细胞完全融化；　

（3）取出冻存管
，用70％乙醇擦拭冻存管表面

；

　　（4）准备15ml离心管，预先加入5mL干细胞培养基
，将细胞悬浮液缓慢逐滴至15mL离心管中，尽量保持细胞聚团状态。

　　（5）在室温300×g离心5分钟。

　　（6）吸掉上清
，注意不要干扰细胞沉淀。使用1mL多能干细胞培养基轻轻地重悬细胞3-5次，不要破坏细胞聚团状态。

　　（7）分别取0.5mL细胞悬液，均匀接种到包被好的6孔板的2个孔中，并分别补充多能干细胞培养基至2m。

　　（8）置于37°C细胞培养箱中
。在前后左右呈十字形摇动培养板板5次，以均匀分散细胞
。

　　（9）每天更换培养基，并显微镜下观察细胞状。