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悬浮细胞培养步骤

悬浮细胞

 

材料:

对于细胞冻存

对数晚期的75 cm2 T型细胞瓶(约40 mL / T瓶)

细胞冻存液(通常含有10%二甲基亚砜 ,DMSO

标记的低温小瓶(对数晚期每40 mL体积的细胞约5个)

 

对于解冻

冷组织培养基

25平方厘米的T型烧瓶

 

细胞冻存程序 :

冻存

1)在显微镜下检查细菌 ,酵母或真菌污染。

2)测试支原体样品。

3)当细胞达到对数晚期时  ,使用Coulter计数器确定细胞密度。计算烧瓶中的细胞总数 ,并确定所需的细胞冻存液的量。 (细胞应重悬于5,000,00020,000,000细胞/ mL的冷冻培养基中。)

冻结

4)将细胞在50mL Falcon管中以1000g离心15分钟    。

5)当细胞旋转时  ,制备细胞冻存液(例如,90FBS ,10DMSO) 。标记低温小瓶 ,包括日期,细胞类型和用户首字母。

6)从离心细胞中吸走上清液并加入细胞冻存液 。研磨细胞直至均匀  。

7)每个低温小瓶快速分装1 mL细胞冻存液 。拧紧每个小瓶  。

8)将小瓶放入储存盒并将用纸巾绝缘的盒子放入Tupperware®容器中  。将整个容器放入-20°C冰箱。

93小时后 ,将容器转移至-80℃冰箱并储存过夜。

10)第二天,将细胞放入液氮罐中的适当架子中 。

后冻结

11)从液氮罐中取出一个小瓶 ,并按照下面的解冻复苏程序测试冻存是否成功。

 

复苏程序 :

1)从液氮罐中慢慢取出适当的托盘架  。取下长安全销,从适当的托盘中取出一个小瓶    。

2)将托盘放回插槽中   ,然后将安全销放回原位。将托盘架再次送回液氮罐和盖罐 。

3)在37°C水浴中快速解冻小瓶,直到只剩下一小块冰粒  。用乙醇喷洒小瓶,擦拭,并放入罩中  。

4)将小瓶(~1mL)的内容物吸移到T25烧瓶中 。

5)缓慢加入4mL冷培养基 ,每10秒钟以约1滴的速度加入 ,偶尔旋转  。再加入5mL培养基   。

6)将烧瓶放入适当的培养箱中 。

7)由于细胞冻存液含有二甲基亚砜(DMSO)   ,6-12小时后将细胞分解并重悬于新T25培养瓶中的新鲜预热培养基中。

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