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贴壁细胞冻存复苏步骤

材料:

磷酸盐缓冲盐水(PBS

胰蛋白酶/ EDTA溶液

组织培养基

细胞冻存液(通常为10%二甲基亚砜,DMSO

带标签的冷冻管(每100毫米板约3个)

100毫米的融合细胞板

 

冻结程序 :

冻存

1)在显微镜下检查细菌   ,酵母或真菌污染 。

2)测试支原体样品 。

 

冻存

3)胰蛋白酶消化细胞(标准方案)。

4)将细胞重悬于培养基中  ,转移至无菌离心管中,以1000RPM4℃离心3-5分钟      。

5)用无菌巴斯德吸管移除上清液 。

6)通过每瓶加入1ml细胞冻存液快速重悬颗粒以冷冻    。

7)每瓶1ml细胞冻存液加细胞,置于冰上。

8)在-80℃下冷冻过夜。

9)将小瓶转移到液氮罐中以无限期储存  。

后冻结

10)从液氮罐中取出小瓶  ,并按照下面的解冻程序测试冷冻是否成功。

 

复苏程序 :

1)温热的组织培养基 ,不选择抗生素至37℃,并标记100-mm组织培养板 。

2)从液氮罐中取出小瓶并在37℃水浴中保持,直至两侧解冻但中心仍然冷冻 。

3)轻轻地将细胞倒入板中。不要摇动小瓶 。

4)向部分冷冻的细胞中滴加9ml温热的培养基 。

5)将板放入培养箱中 。

6)细胞附着后立即更换培养基(去除DMSO )。

细胞冻存.jpg

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