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如何进行贴壁细胞的细胞冻存和复苏?

我正面临冻存贴壁细胞(HepG2HUCCT1)的问题 。我不知道如何冻存和复苏的方法

在我开始新的培养后,细胞不会附着在培养皿上 。他们可能已经死了 !

谁能告诉我一个好的细胞冻存/细胞复苏?


 

一般而言 ,当您制作细胞库/冷冻细胞时  ,您应用的原则似乎适用于大多数哺乳动物细胞培养系统。我必须承认,900 uL血清和100 uL DMSO过量,但您正在应用90%血清和10%DMSO 细胞冻存液 ,这很好  。

正如一些人已经评论过的,一些实验室使用不同的冷冻培养基混合物 ,如70%培养基,20%血清和10%DMSO   。这就是我用于哺乳动物细胞培养的方法。但考虑到你的冷冻媒体似乎没有明显的问题  ,我建议你看看早期的部分    。

这样的部分将是   :细胞传代数(你决定用它来创建你的细胞库 - 通常是第7-9段是最好的细胞培养物使用 ,而大多数细胞超过20次传代应该被丢弃)  ,细胞密度/ mL(标准通常> 1,000,000 / mL),前的任何明显污染 ,冷冻培养基中使用的血清年龄  ,所用血清的来源(血清从原产地到同一来源的均匀分批变化很大) ,冷冻机制(使用慢速冷冻 - 先生Freezey iso-proponal冷冻装置)  ,最后你的解冻方案。

任何标准解冻方案应该在37℃解冻时快速进行 ,然后进行初始平板加上使用的解冻培养基   。我将解冻的细胞在80%培养基+ 20%血清(无抗生素)中培养2小时。然后用温PBS(不含Mg2 +或Ca2 +)彻底洗涤以除去DMSO,然后加入更多的解冻培养基孵育24小时。在此之后,您应该将介质更换为正常的培养基,在第一次通过前离开24-48小时。

我的正常程序是使用HAKATA无血清细胞冻存液

移液到冷冻管,快速工作 。

接下来,直接冻存 :直接放置在-80℃冰箱中。然后根据需要转移到液氮中 。

为了解冻 ,在37℃浴中快速加热       ,转移到管中   ,慢慢加入培养基 ,直到你有你想要的体积   。我第二天更换了培养基 ,但是对于一些细胞 ,最好立即离心并更换培养基   。

编辑   :坦率地说 ,回顾过去  ,这种方法是导师教给我的方法    ,但我没有强有力的证据表明这一点至关重要 。我总是这样做 ,结果很好  ,所以我坚持下去 。

细胞冻存液


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