必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃
，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化



，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶
，对细胞造成损害。

细胞复苏步骤

一.实验前准备：
将水浴锅预热至37℃

。
细胞实验室进行常规消毒


，用75％酒精擦拭并且使用紫外线照射40min的超净工作台台面
。
在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管
、吸管、培养瓶等
。

二．取出冻存管

：
根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞



，同时核对管外的编号
。

三．迅速解冻

：
迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻，并要不断地摇动
，使管中的液体迅速融化

。
约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

四.平衡离心


：
用架盘天平平衡后


，放入离心机中1000r/min
，离心5min

。

五.制备细胞悬液

：
吸弃上清液


。
向离心管内加入10ml预热的培养液，吹打制成细胞悬液


。
用培养液悬液混悬沉淀细胞，调整细胞浓度




，放培养箱中培养。

六.细胞计数：
细胞浓度以5×105/ml为宜。

七.培养细胞



：
将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养


，换液的时间由细胞情况而定。

八. 记录复苏日期：
细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面容易出问题的部分




，因此必须注意以下几点~

注意无菌操作。
取细胞的过程中可能会接触液氮，一定注意带好防冻手套，护目镜
。
此项尤为重要，如果冻存管密封不严
，细胞冻存管可能漏入液氮


，解冻时



，在水浴中摇晃
，冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸
，所以



，一定要戴保护眼镜和手套
，复苏过程中应盖上恒温水浴锅的盖
。
应在1-2min内使冻存液完全融化
。如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤

。另外
，细胞复苏后的操作Hao在4℃冰浴中进行


，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
复苏过程中，升温的速率要大
，把从液氮取出的细胞在短的时间内放入水浴锅。
离心前须加入少量培养液




。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤
。

细胞贴壁少的问题

：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15ml培养液
，经验总结，培养基越少细胞越容易贴附。
复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般根据情况可分装到1-2只培养瓶中
，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。
加培养基的量放入问题


：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果加培养基的太少



，DMSO的浓度就会比较大

，就会影响细胞生长

，从以前的资料来看



，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响





。还有一个说法是1％


。所以如果冻存液的浓度是10％DMSO，那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度

。

初学者易犯的错误：
水浴锅未预热或者未预热到37℃直接融化。
水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳



，使融化时间延长。
离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失

。
一次复苏细胞种类过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染

。
解冻后的细胞要用和以前一样的培养液和血清。因为每一种细胞都有自己特定的



，并且已经熟悉了的生长环境
。突然使用不一样的培养液和血清

，会造成细胞生长不良
，甚至死亡
，像水土不服一样。

结果分析


：
判断细胞复苏成功与否，需要看复苏后细胞贴壁率及细胞存活率（细胞存活率将冻存管内剩余的细胞

，用台盼蓝染色法检测复苏细胞的存活率
。呈蓝色的细胞为死细胞

，活细胞不着色
。用细胞计数板和计数器计数细胞
，得出细胞存活率）。如果复苏后95%以上的细胞贴壁，而且细胞的活性好，这就说明细胞复苏的过程没有问题。复苏的细胞恢复到正常生长

，达到正常的生长特性（比如细胞群体倍增时间等）后要再冻存以补充细胞储存数量。