1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如杂交瘤细胞应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生 。1.3.注意冷冻保护剂之品质 。DMSO应为试剂级等级 ，无菌且无色 。4℃避光保存 ，勿作多次解冻 。甘油亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用 ，因长期储存后对细胞会有毒性 。1.4.冷冻保存之细胞浓度： DMSO 的浓度介于 5%~20% 之间。生长培养液的体积应调整以适于所用细胞保护剂的变化 。1.4.1.正常人成纤维细胞:1-3×106 cells/ml1.4.2.杂交瘤细胞:1-3x106cells/ml，细胞浓度不要太高 ，某些杂交瘤细胞会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。1.4.3.贴壁的肿瘤细胞系:5-7x106cells/ml ，依细胞种类而异 。腺癌解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1-3×106cells/ml 。1.4.4.其他悬浮细胞:5-10× 106cells/ml,humanlymphocyte须至少5×106cells/ml。1.5.冷冻保护剂浓度为5%或10%DMSO ，若是不确定细胞之冷冻条件 ，在做冷冻保存之同时 ，亦应作一个对照培养，以防止冷冻失败 。+n62.细胞冷冻保存的具体操作2.材料 ：2.1.生长良好之培养细胞2.2.新鲜培养基2.3.DMSO(SigmaD-2650)2.4.无菌塑料冷冻保存管2.5.0.4％ w/v台盼蓝2.6.血球计数盘与盖玻片2.7.等速降温机(KRYO10SeriesII)3.步骤 ：3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。3.2.配制冷冻保存溶液(使用前配制) ：将DMSO加入新鲜培养基中 ，最后浓度为5-10％ ，混合均匀 ，置于室温下待用。3.3.依细胞继代培养之操作 ，收集培养之细胞 ，取少量细胞悬浮液(约20ul)计数细胞浓度及冻前存活率。3.4.离心，去除上清液 ，加入适量冷冻保存溶液 ，对应细胞适合的冻存密度混合均匀 ，分装于已标示完全之冷冻保存管中 ，1ml/管，并取少量细胞悬浮液作污染检测 。3.5.冷冻保存方法 ：在每一个冻存管上注明细胞系的名字 ，冻存者姓名和冻存时间，方便日后寻找 。将一批细胞用橡皮筋捆绑住 ，用足够多的棉花将冻存管包裹 ，包括烧杯的底座和瓶顶 ，保护细胞逐级冷却，防止过快冷冻产生的冰晶破坏细胞状态 ，放入-80℃冷冻 ，然后放置于液氮中。
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