双抗

一






、什么是双抗
？

青霉素加上链霉素，俗称“双抗”

。

二


、培养液中需要加入双抗吗？

加不加双抗不是绝对的，视实际情况而定
。

如果你实验室条件足够好
，如果你操作足够规范
，就尽量不要加双抗了。

相反



，如果你实验条件不够

，操作也没有绝对把握
，还是加的好。

好的方法是做个实验对照，看有没有必要加双抗。

三、如何加双抗
？

加在DMEM里
，因为如果是直接在换液传代滴加的话





，那个双抗的浓度实在不好控制，如果加多了话对细胞毒性太大
，如果担心时效


，可以Z在培养液配好后分装于100ml的小玻璃瓶中


，在每启用一瓶之前加


，加了之后应尽快用完
。

胰酶

一
、胰酶使用的时候要注意什么
？

1




、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。

2
、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差

。

二
、以贴壁细胞的消化为例：

1
、吸去培养液

，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清；

2

、加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可
，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量。室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同）

3
、显微镜下观察
，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来

。

4、此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞
，即可直接用于后续实验如果发现消化不足





，则加入胰酶细胞消化液重新消化





。

如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞
，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来

。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞

，即可用于后续实验。

常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin）




，EDTA等，其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解，改变细胞间的连接






，使组织或细胞片分散成单个细胞




，制成细胞悬液用于进一步的实验
。

影响消化速度的因素较多
，主要有胰酶溶液的活性（配制条件
、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融


、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少等 

。

加入胰蛋白酶-EDTA溶液

，视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多（依培养器皿的大小而定），以使充分浸润；

一般消化时间约为1至3分钟

，肉眼观察瓶底由半透明（细胞单层连接成片）转为透明

、点状（出现细小空隙）时，弃去细胞消化液，或看见培养瓶壁呈白茫状即可。并加入适量的完全培养液终止消化，吹打分散；如见大量细胞片状脱落，已消化过头
，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作
。（消化过头



，可造成大量细胞从瓶壁上脱下
，甚至造成细胞破碎。由于血清含有非特异性胰蛋白酶抑制剂
，所以加入完全培养基可以终止反应



。